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巨细胞病毒重组抗原的制备纯化及鉴

摘要】目的应用生物信息学技术对人类巨细胞病毒

(HumanCytomegalovirus,HCMV)分子进行抗原表位预测,构建并表达具有多表位的重

组融合蛋白并进行免疫原性鉴定.方法GenBank中查询HCMV氨基酸序列,利用

BepiPred、ABCpred、BcePred、PREDICTED四种在线表位预测软件进行细胞表位预

测,筛选出可能的抗原决定簇表位,构建、原核表达,并利用免疫印迹实验筛选出可

用的表位抗原,原核表达出融合蛋白,用WesternBlot和ELISA检测其抗原性.结果

综合预测分析结果,得出１３种可能的表位,构建出pET３２a原核表达载体,表达并

纯化这１３种表位的融合蛋白,经免疫印迹技术筛选出gp５２、GB３、PP１５０

－１、GB－５具有较强的抗原性表位,通过Ni２＋亲和柱纯化,对gp５２融合蛋白

免疫印迹试验结果表明,蛋白抗原性较强;ELISA法鉴定具有较高的抗原性及特异性.

结论在原核表达系统中能获得高效表达,纯化的融合蛋白具有较强的免疫反应性,

对后期建立人HCMV免疫检测试剂提供了可能性.【关键词】预测软件;抗原表

位;原核表达;纯化;鉴定【中图分类号】R３９２．１【文献标识码】

B【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１２－０１４０－０１

血清免疫诊断[１－２]仍是现价段巨细胞病毒诊断的主要手段,但病毒来源的

抗原存在敏感性、特异性等问题,基因工程方法获得的表达产物作为抗原已引起各

国学者的重视.本文应用生物信息学技术对人类巨细胞病毒

(HumanCytomegalovirus,HCMV)分子进行抗原表位预测,现报告如下:材料和方法

１材料

１．１试剂和仪器本实验采用的质粒抽提试剂盒采购至Omega公司;异

丙基－β－半乳糖苷(IPTG)、氨苄青霉素(AMP)、酵母提取液、胰蛋白胨购自Sigma

公司;低分子量蛋白标准品采购自赛默飞世尔公司;HiTrapDesalting脱盐柱、

HisTrapHPNi２＋亲和柱采购自GEHealthcare公司;恒温培养摇床采购自上海福玛

公司;凝胶扫描仪、蛋白电泳仪为美国伯乐公司产品.１．２HCMV氨基酸序列

根据GenBank中公布的HCMV全长的氨基酸序列作为表位预测依据.

１．３计算机预测软件采用Predicted、ABCpred、BcePred、BepiPred在

线预测软件以及美国DNAstar公司Lasergene７．１０软件.１．４质粒、菌株

与抗体质粒pET３２a(G１－G８、pp６５－１、pp６５－２、gp５２、pp１５０

－１、pp１５０－２)由上海捷瑞公司合成;大肠杆菌BL２１及Rosetta(DE３)为本

实验室保存;羊抗兔抗体购自Sigma公司.抗HCMV阳性血清来自本实验室确诊

HCMV病人血清.

２方法２．１表位预测将查询的HCMV氨基酸序列输入到预测软件中,

利用一级序列中的氨基酸柔性、局部亲水性、突出指数以及二级结构的转角与环

结构等进行B细胞表位预测,综合五种软件的预测结果进行分析.２．２融合蛋

白诱导表达重组质粒转化至Rosseta菌中,取１００μL转化液均匀涂抹至氨苄培

养基中.取生长良好的挑单克隆于氨苄青霉素终浓度为０．１mg/mL的LB培养液

中,１:１００转接至１０mL氨苄青霉素终浓度为０．１mg/mL的LB培养液中,检

测菌液OD６００值至０．４－０．６,加入终浓度为０．１mmol/L异丙基－β－

半乳糖苷(IPTG).至聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)观察融合蛋白表达情况.

２．３融合蛋白纯化可溶性融合蛋白纯化小量诱导成功后.按照HiTrapHP

操作说明,安装好纯化系统.２．４脱盐按照HiTrapDesalting操作说明安装好

脱盐系统,SDS－PAGE跑胶后用BCA法测蛋白量,－８０℃保存备用.２．５免疫

反应原性检测用Bio－Rad凝胶成像采集图像,观察结果.用０．１