3.2.2 基因工程的基本操作程序-高二生物实践教学课件（人教版2019选择性必修3）.pptx

第三章第二节

基因工程的基本操作程序（2）

重组DNA技术的基本工具重组DNA分子胰岛素基因DNA限制酶限制酶DNA连接酶载体重组DNA分子大肠杆菌导入

PCR技术

目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞第一步第二步第三步第四步目的基因的检测与鉴定基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序

1.用化学方法人工合成2.从基因文库中获取3.通过PCR技术体外扩增

1.构建的目的（1）让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。（2）同时使目的基因能够表达和发挥作用。基因表达载体抗虫基因与载体拼接（基因工程的核心）

2.载体组成（1）启动子：①本质：一段有特殊序列结构的片段。DNA②功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。表达载体启动子目的基因终止子复制原点（基因工程的核心）（2）终止子：①本质：一段有特殊序列结构的片段。②功能：使转录在所需要的地方停下来。DNA

（3）标记基因：①作用：便于重组DNA分子的筛选。②常见类型：抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。启动子终止子标记基因复制原点目的基因（基因工程的核心）主要是指编码蛋白质的基因，能控制表达所需要的特殊性状，如Bt基因。（5）复制原点：DNA复制的起始位点。注意：目的基因必须插入到与之间。启动子终止子（4）目的基因：

启动子终止子起始密码子终止密码子本质位置功能启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的比较DNA片段DNA片段mRNA上三个相邻的碱基mRNA上三个相邻的碱基目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA使转录在所需要的地方停下来翻译的起始信号（编码氨基酸）翻译的结束信号（不编码氨基酸）

4.限制酶的选择原则如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SamⅠ。所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。(1)不破坏目的基因原则：(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：思考

通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（或为了保证目的基因和质粒发生定向连接）可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒。(3)确保出现相同黏性末端原则：思考4.限制酶的选择原则

载体（质粒）DNA分子（含目的基因）限制酶处理带有黏性末端或平末端的切口带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种问题：该过程需要用到基因工程哪些工具？3.构建过程

问题探讨：1、使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？载体目的基因自连片段间的连接目的基因自连质粒自连目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接正向连接反向连接11’22’122’1’22’1’1

2.如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割-G-CTTAA-A-TCTAG问题探讨：-G-CTTAA3.要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。

下列哪项不是基因表达载体的组成成分()A.启动子 B.终止密码子 C.标记基因 D.复制原点[解析]启动子、标记基因、复制原点是基因表达载体的组成成分，终止密码子是mRNA上的三个碱基，终止翻译的作用，B错误。B

植物细胞动物细胞微生物细胞农杆菌转化法花粉管通道法我国科学家独创常用显微注射法Ca2+处理法将目的基因导入受体细胞的方法有哪些？各自适用于什么生物？

生物种类植物动物微生物常用方法受体细胞转化过程受精卵Ca2＋处理法花粉管通道法体细胞或受精卵农杆菌转化法(常用）将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达显微注射法将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物原核细胞Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入课P80

花粉外源DNA花粉管子房胚珠（1）花粉管通道法：②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。我国科学家独创的一种方法课P811.将目的基因导入植物细胞

（2）农杆菌转化法①转化：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体