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第３２卷／第１期／河北师范大学学报／自然科学版／Ｖｏ１．３２Ｎｏ．１

２００８年１月ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＨＥＢＥＩＮＯＲＭＡＬＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ／ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＥｄｉｔｉｏｎ／Ｊａｎ．２００８

新型ｒＰＡ（Ｋ）原核表达载体的构建及初步表达

罗惠霞，李敏，王玉炯，李稷亮

（宁夏大学生命科学学院，宁夏银川７５００２１）

摘要：利用ＰＣＲ技术，获得了ｒＰＡ（Ｋ）ｃＤＮＡ片段，将其克隆至ｐＥＴ一３０ａ（＋），成功构建了新型的ｒＰＡ（Ｋ）原

核载体ｐＬｒＡ（Ｋ），并实现了其在大肠杆菌中的初步表达，经ＩＰＴＧ（终浓度为１ｍｍｏｌ／Ｌ）分别于３７℃诱导１，２，３ｈ

后，以Ｂｉｏ－Ｒａｄ凝胶成像仪分析目的蛋白，相对含量分别是１９％，１５．８％和２４．３％，平均密度分别是０．１３，０．１４和

０．１６，ＩＰＴＧ诱导３ｈ后蛋白表达量最高．ＥＬＩＳＡ结果显示表达产物与抗ｔ—ＰＡ抗体呈现特异性阳性反应，进一步参

考标准曲线得出样品中ｒＰＡ（Ｋ）的平均含量为２１０￣ｔｇ／Ｌ．

关键词：组织型纤溶酶原激活剂；ｒＰＡ（Ｋ）；原核表达

中图分类号：Ｑ８１文献标识码：Ａ文章编号：１０００．５８５４（２００８）０１．００９４—０４

ｒＰＡ是经过人为改造，由天然ｔ－ＰＡ的１—３和１７６—５２７位的氨基酸组成的新型溶栓制剂．与ｔ～ＰＡ相

比，在溶栓效率等方面有了较大的提高．但在ｒＰＡ分子结构上，仍存在ＰＡｌ一１（纤溶酶原激活剂抑制物一１）结

合位点（Ｌｙｓ２９６一Ｈｉｓ—Ａｒｇ—Ａｒｇ２９９，ＫＨＲＲ），该位点的去除可能会进一步延长ｒＰＡ的半衰期［引．因此，李敏

等【３Ｊ利用ＰＣＲ和点突变技术，获得了ｒＰＡ的点突变体ｒＰＡ（ＫＨＲＲ２９６～２９９ＡＡＡＡ）（简称为ｒＰＡ（Ｋ）），并进一

步构建了其原核表达载体ｐＥｒＡ（Ｋ），实现了其在原核系统中的初步表达．但该表达系统存在一定缺陷：ｒＰＡ（Ｋ）

是以融合蛋白的形式进行表达的，即在表达产物之前存在非目的片段，使得临床使用时将会引起机体的过敏反

应；而且如果对其进行纯化，则必须使用价格昂贵的Ｌｙｓ－ｓｅｐｈａｍｓｅ或Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ层析柱，从而提高了研究成本．鉴

于以上原因，同时为了降低研究成本，方便ｒＰＡ（Ｋ）的表达、检测和纯化等后续工作，笔者实验利用ＰＣＲ技术将

ｒＰＡ（Ｋ）ｃＤＮＡ克隆至原核表达载体ｐＥＴ一３０ａ（＋）中，构建了ｒＰＡ（Ｋ）的新型原核表达载体．

１材料与方法

１．１材料

１．１．１菌株及质粒

含有ｒＰＡ（Ｋ）基因的质粒载体ｐＥｒＡ（Ｋ）由笔者所在实验室李敏等人构建；表达载体ｐＥＴ一３０ａ（＋），宿主

菌大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）均为笔者所在实验室保存．

１．１．２主要试剂

限制性内切酶ＸｈｏＩ，ＮｏＩ，ｔＩＨ，ＫｐｎＩ，ＢｇＩｌＩ，ＤＬ１５０００Ｍａｒｋｅｒ，Ｌｏｗ—ＲａｎｇｅＰｒｏｔｅｉｎＭａｒｋｅｒ为宝泰克公

司产品；ＴＥＭＥＤ，Ｔ４连接酶，ＷｉｚａｒｄＰＣＲｐｒｅｐＤＮＡＰｕｒｉｓｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ为Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品；ｔ－ＰＡ含量测

定（ＥＬＩｓＡ）试剂盒为上海太阳生物制品公司产品．

１．２主要方法

１．２．１ｒＰＡ（Ｋ）ｃＤＮＡ片段的获得

１．２．１．１引物设计

根据ｒＰＡ（Ｋ）的ｃＤＮＡ序列【３０Ｊ及引物设计原则设计了一对引物，为便于亚克隆，在引物序列中加入ＢｇｌⅡ，

ＸｈｏＩ的酶切位点：引物１为５－＇ｇＣＡｇ／ＷＣＦｇｇｇＴＡＣＣｇＡＣｇＡＣｇＡＣｇＡＣＡＡｇＴＣＴＴＡＣＣＡＡｇｇＡｇｒｒｇＡＣｒＡＣ

ＴＴＴｇｇ－２７；引物２为５ＡＴＣＴＣｇＡｇＴｇＡｇｇＡｇＴＣｇｇｇＴｇＴＴＣＣＩ＂～３．

收稿Ｅｔ期：２００７—１０—１２；修回日期：２００７—１１—２０