组织培养的方法和步骤.pdf

组组织织培培养养的的⽅⽅法法和和步步骤骤

组织培养的⽅法和步骤

培养材料的采集

要根据培养⽬的适当选取材料，选择原则：易于诱导带菌少。要选取植物组织内部⽆菌的材料。这⼀⽅⾯要从健壮的植株上

取材料，不要取有伤⼝的或有病⾍的材料。另⼀⽅⾯要在晴天，最好是中午或下午取材料，决不要在⾬天阴天或露⽔未⼲时

取材料。因为健壮的植株和晴天光合呼吸旺盛的组织，有⾃⾝消毒作⽤，这种组织⼀般是⽆菌的。培养材料的消毒

从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微⽣物。这些污染源⼀旦带⼈培养基，便会造成培养基污染。因此，植

物材料必须经严格的表⾯灭菌处理，再经⽆菌操作⼿续接到培养基上。

第⼀步，将采来的植物材料除去不⽤的部分，将需要的部分仔细洗⼲净，如⽤适当的刷⼦等刷洗。把材料切割成适当⼤⼩，即

灭菌容器能放⼈为宜。置⾃来⽔龙头下流⽔冲洗⼏分钟⾄数⼩时，冲洗时间视材料清洁程度⽽宜。易漂浮或细⼩的材料，可装

⼊纱布袋内冲洗。流⽔冲洗在污染严重时特别有⽤。洗时可加⼊洗⾐粉清洗，然后再⽤⾃来⽔冲净洗⾐粉⽔。洗⾐粉可除去轻

度附着在植物表⾯的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。当然，最理想的清洗物质是表⾯活性物质—吐温。

第⼆步是对材料的表⾯浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯玻璃棒70%酒精消毒液⽆菌⽔⼿

表等。⽤70%酒精浸10～30s。由于酒精具有使植物材料表⾯被浸湿的作⽤，加之70%酒精穿透⼒强，也很易杀伤植物细胞，

所以浸润时间不能过长。有⼀些特殊的材料，如果实花蕾包有苞⽚苞叶等的孕穗，多层鳞⽚的休眠芽等等，以及主要取

⽤内部的材料，则可只⽤70%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在⽆菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取⽤内部材料。

第三步是⽤灭菌剂处理。表⾯灭菌剂的种类较多，可根据情况选取1—2种使⽤见表。第四步是⽤⽆菌⽔涮洗，涮洗要每次

3min左右，视采⽤的消毒液种类，涮洗3-l0次左右。⽆菌⽔涮洗作⽤是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作⽤注意：①酒精渗透性

强，幼嫩材料易在酒精中失绿，所以浸泡时间要短，防⽌酒精杀死植物细胞。②⽼熟材料，特别是种⼦等可以在酒精中浸泡时

间长⼀些，如种⼦可以浸泡5分钟。③升汞的渗透⼒弱，⼀般浸泡10分钟左右，对植物材料的杀伤⼒不⼤。④漂⽩粉容易导致

植物材料失绿，所以对于幼嫩材料要慎⽤。⑤在消毒液中加⼊浓度为0.08—0.12%的吐温20或80（⼀种湿润剂），可以降低植

物材料表⾯的张⼒，达到更好的消毒效果。灭菌剂使⽤浓度(%)持续时间（min）去除的难易效果次氯酸钙9~105~30易很好

次氯酸钠25~30易很好

氯化汞0.1~15~8较难最好

抗菌素4~50mg/L30~60中较好

制备外植体

将已消毒的材料，⽤⽆菌⼑剪镊等，在⽆菌的环境下，剥去芽的鳞⽚嫩枝的外⽪和种⽪胚乳等，叶⽚则不需剥⽪。在操

作中严禁⽤⼿触动材料。

接种和培养（⼀）接种

在⽆菌坏境下，将切好的外植体⽴即接在培养基上，每瓶接种1－2个，以防⽌交叉污染。（⼆）封⼝接种后，瓶管⽤⽆菌

药棉或盖封⼝，培养⽫⽤⽆菌胶带封⼝。（三）温度

培养基⼤多应保持在25℃左右，但要因花卉种类及材料部位的不同⽽区别对待。

增殖

外植体的增殖是组培的关键阶段，在新梢等形成后为了扩⼤繁殖系数，需要继代培养。把材料分株或切段转⼊增殖培养基中，

增殖培养基⼀般在分化培养基上加以改良，以利于增殖率的提⾼。增殖1个⽉左右后，可视情况进⾏再增殖。

根的诱导

继代培养形成的不定芽和侧芽等⼀般没有根，必须转到⽣根培养基上进⾏⽣根培养。1个⽉后即可获得键壮根系。

组培苗的炼苗移栽试管苗从⽆菌到光温湿稳定的环境进⼊⾃然环境，必须进⾏炼苗。⼀般移植前，先将培养容器打开，于

室内⾃然光照下放3天，然后取出⼩苗，⽤⾃来⽔把根系上的营养基冲洗⼲净，再栽⼊已准备好的基质中，基质使⽤前最好消

毒。移栽前要适当遮荫，加强⽔分管理，保持较⾼的空⽓湿度（相对湿度98％左右），但基质不宜过湿，以防烂苗。