16 基因工程实验设计.ppt

*P221……………………..*切点在哪没关系，因为会原样补回去。关键要保证3个核苷酸为一组。*密码子的偏好性P114*包涵体P117*5’附加酶切位点(定向克隆)1、不同酶的保护碱基序列不同；NEBcatalog提供相关资料。2、有些酶的保护碱基包含其它酶切位点，注意双酶切的先后顺序:Nde1?EcoR1引入点突变1.一条引物最多引入3个点突变,可延长引物长度.2.突变位点要靠近5’端.3.要注意密码子的偏好性,简并性有不确定序列－－（3～4种）5’ATGGGCICCAIAICTTCTACC3’说明：1、次黄嘌呤核苷酸I可与四种碱基配对；2、可用于PCR产物直接测序。有不确定序列－－（2种）5’ATGGGCACCATAGCTTCTA(A/C)C3’说明：1,表示该位点有两种可能的序列A或C;2.合成引物时只要一条引物的money;实际得到的是两条引物等比例的混合物：5’ATGGGCACCATAGCTTCTAAC3’5’ATGGGCACCATAGCTTCTACC3’3、设计时可靠近3‘端4、不能用于PCR产物直接测序目的基因的表达目的基因表达系统泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的宿主细胞，并能在其中有效表达，产生目的蛋白。目的基因表达系统：表达载体+宿主细胞常见的表达系统1、大肠杆菌表达系统（原核）2、酵母表达系统（真核）3、动物细胞表达系统4、昆虫表达系统（家蚕表达系统）5、植物表达系统6、动物表达系统（乳腺反应器，输卵管反应器）表达载体的类型融合型表达载体：----融合蛋白非融合型表达载体：---天然完整蛋白分泌型表达载体：----产物可跨膜分泌至胞周间隙大肠杆菌表达载体的基本条件复制子：复制起点（ori）启动子和终止子核糖体结合位点：SD序列密码子选择标记常用的融合表达载体PTXB（pTYB)系列：N端(或C端）融合CBD蛋白，用chitin柱亲和纯化；DTT诱导柱上切割纯化。PGEX系列：N端融合GST蛋白，用GST柱亲和纯化；谷胱甘肽洗脱，用Xa因子酶切除去亲和Tag。pET系列：融合6hisTag,用镍柱亲和纯化，用咪唑洗脱，用Xa因子酶切除去亲和Tag。。融合蛋白的功能1、提高外源基因的表达量2、帮助外源基因正确折叠（可溶）3、提供亲和标记，方便纯化；4、提供亲和标记的还可作为检测靶点，方便检测。Intein:DTT诱导自剪切CBD：chitinbindingdomain（几丁质结合位点）MCS:多克隆位点Amp：Amp抗性基因位相载体----含有3种读码框的系列载体MCIGST-P9Factor-XaP9976643311420kDa蛋白表达中常见问题一、真核基因在原核中表达：1、要用原核基因的表达载体（P,O,SD）2、要去除内含子（mRNA制备）3、密码子的偏好性4、要注意插入读框正确。5、表达蛋白的稳定性：（1）使用蛋白酶缺失的工程菌：（Ion-蛋白酶缺失的工程菌）（2）使用融合蛋白6、防止产生包涵体：（1）使用融合蛋白，帮助正确折叠；（2）使用辅助质粒，产生分子伴侣，帮助正确折叠（3）降低温度，缓慢表达，帮助正确折叠；（4）减少诱导剂的量，缓慢表达，帮助正确折叠；（5）使用不同的培养基和金属添加剂。（6）使用低拷贝的质粒遗传密码原核表达系统和真核表达系统一、原核表达的优缺点：1、表达量大，成本低，操作简单。2、不能进行修饰，可能有些蛋白没有生物活性。二、真核表达系统:1、表达量低，成本高，操作复杂；2、能进行翻译后修饰，保持蛋白的生物活性。一般是基因上没有或1个的酶切位点*载体脱磷，连接后得到的杂种DNA分子上会留下3’-OH和5’-OH的缺口。尽管如此，这样的DNA分子仍然可以导入细菌细胞，并在寄主细胞被完成缺口的修复工作。**若PCR时退火温度偏低，会降低特异性，但扩增效率提高*添加原则添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的，见附表。添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布