18. 基因工程引物设计和表达设计-zsy.ppt

原核表达系统和真核表达系统一、原核表达的优缺点：1、表达量大，成本低，操作简单。2、不能进行修饰，可能有些蛋白没有生物活性。二、真核表达系统:1、表达量低，成本高，操作复杂；2、能进行翻译后修饰，保持蛋白的生物活性。添加原则编辑添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的，见附表。添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。**密码子的偏好性P114*包涵体P117*PCR技术原理循环过程(32次左右）1.解链：94℃,30s2.引物结合:？℃，30s3.延伸：72℃，？Min特点1.引物两条，以2n指数扩增（前20-25次），后面扩增效率降低，30次以后，基本进入平台期。2.引物结合温度？℃一般为50-55℃，需要调整；3.延伸时间？Min需要调整，一般1kb/min.PCR技术应用1.基因检测；2.基因的制备（包括基因的修饰）PCR技术操作要点1.灵敏度高，防止污染，出现假阳性(带手套，设立阴性，阳性对照）；2.特异性----A.引物的设计;B.退火温度;3.PCR扩增程序的设计;4.平台期,5.dimer的形成.引物的设计常规设计原则特殊用途设计技巧引物常规设计原则1.长度：15~37nt,一般20nt左右;(仅binding,不含接头)2.G+C含量４０％～６０％3.避免聚嘌呤或聚嘧啶或有回文对称结构；4.引物自身不能互补（3个）5.引物之间不能互补（5?个）6.引物３端不能错配,不能修饰，尽量不用A,不能超过３个连续的G或C；7.５端可变化修饰，附加酶切位点；8.两引物的Tm值应比较接近；9.正链引物：mRNA序列照抄；负链引物：先写出mRNA序列的互补序列，然后翻转重写。１０．解链温度Tm=4(G+C)+2(A+T)[=20nt]Tm=81.5+0.41*(GC%)-600/L[20nt]Tm一般55℃～70℃［５５℃～５８℃最佳］PCR反应中结合温度（annealingtemperature）T=Tm-5℃特殊用途引物设计技巧1.5’附加酶切位点(定向克隆):2.引入点突变3.有不确定序列4.PCR产物直接测序5’附加酶切位点(定向克隆)1、不同酶的保护碱基序列不同；NEBcatalog提供相关资料。2、有些酶的保护碱基包含其它酶切位点，注意双酶切的先后顺序:Nde1?EcoR1引入点突变1.一条引物最多引入3个点突变,可延长引物长度.2.突变位点要靠近5’端.3.要注意密码子的偏好性,简并性有不确定序列－－（3～4种）5’ATGGGCICCAIAICTTCTACC3’说明：1、次黄嘌呤核苷酸I可与四种碱基配对；2、可用于PCR产物直接测序。有不确定序列－－（2种）5’ATGGGCACCATAGCTTCTA(A/C)C3’说明：1,表示该位点有两种可能的序列A或C;2.合成引物时只要一条引物的money;实际得到的是两条引物等比例的混合物：5’ATGGGCACCATAGCTTCTAAC3’5’ATGGGCACCATAGCTTCTACC3’3、设计时可靠近3‘端4、不能用于PCR产物直接测序目的基因的表达目的基因表达系统泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的宿主细胞，并能在其中有效表达，产生目的蛋白。目的基因表达系统：表达载体+宿主细胞常见的表达系统1、大肠杆菌表达系统（原核）2、酵母表达系统（真核）3、动物细胞表达系统4、昆虫表达系统（家蚕表达系统）5、植物表达系统6、动物表达系统（乳腺反应器，输卵管反应器）表达载体的类型融合型表达载体：----融合蛋白非融合型表达载体：---天然完整蛋白分泌型表达载体：----产物可跨