13. 工具酶-zsy 本科精品课件.ppt

***待连接的DNA片段携带由限制酶产生的粘性末端，在较低的温度下粘性末端退火形成含有两个交叉切口的互补双链，再由连接酶进行连接（1分）。而多数粘性末端的Tm值在15℃以下,就理论而言，连接反应温度应以不高于Tm值为宜，否则粘性末端DNA分子形成的配对结构极不稳定（3分）。然而保持连接酶活性的最适温度却是37℃,因此反应最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折衷，经常采用15℃（7-15℃）（1分）*来自古细菌嗜热水生菌*DNA探针的标记的方法见李海英教材P202切除3’凸端时，需加入足够的dNTP，否则外切酶活性不停止。补平3’凹端时，Klenow酶会表现出外切酶活性**反转录酶的5`→3`聚合酶活性，取决于有一段引物和一条模板分子的存在。此图第一步是，用5’末端特异的核酸外切酶处理DNA片段A和B,形成延伸末端。*(1)衔接体技术衔接体是指人工合成的一段由8~12个核苷酸组成的、具有一个或多个限制酶切割位点的平末端双链DNA短片段。利用连接酶将衔接体连接到平末端的目的分子上，然后用衔接体内包含的限制酶消化，产生带有所需粘性末端的目的分子。(2)人工接头技术人工接头是人工合成的DNA分子，一边是平末端，一边是粘末端。通过修饰将人工接头粘性末端的的5’-P换成5’-OH,以防止人工接头之间通过粘性末端形成二聚体。利用连接酶将人工接头连接到平末端的目的分子上，并通过多核苷酸激酶5’-OH换成5’-P，即得到了带有粘性末端的目的分子。(3)同聚物加尾技术??**补充：DNA连接酶的反应条件Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTT7-15℃4-16hr1UDNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15℃反应1小时，完全连接1mgl-DNA（HindIII片段）所需的酶量。DNA聚合酶Taq酶Klenow酶反转录酶末端转移酶Taq酶耐热DNA聚合酶:94℃能较长时间保持活性,最适温度72℃;方向:5’?3’底物:模板+引物+dNTP(还需Mg2+)反应速度:1kb/min不同种类的Taq酶功能不同.用途:(1)PCR(2)sequence等Klenow酶特点:DNA聚合酶Ⅰ的C-端大片段(被枯草杆菌蛋白酶切割)MW＝76kD5`→3`聚合酶活性(合成)4.3`→5`外切酶活性(矫正)用途:DNA探针的标记2.平端化:切除3’凸端或补平3’凹端反转录酶(reversetranscriptase)两种:AMV(来源于鸟类肿瘤病毒)--------42℃反应M.MLV(来源于鼠白血病毒)-------37℃反应主要特点:(1)RNADNA（√）(2)DNADNA(3)外切RNA(4)不具有纠错功能用途：(1)mRNA转录成cDNA(2)以ssDNA或RNA为模板合成杂交探针末端转移酶(terminaltransferase)1.取自小牛胸腺2.催化脱氧核苷酸与DNA的3’-OH结合引物或底物是带有3`-OH基的ssDNA或带有突出的3’-OH基的双链DNA。不要求模板。3.两种反应：Mn2+或Mg2+ssDNAOH+ndNTPDNA-(pdN)n+nppiCo2+dsDNAOH+ndNTPDNA-(pdN)n+nppi4、用途：加一个同源多聚物，便于未知序列的操作。修饰酶1、T4多核苷酸激酶2、碱性磷酸酶3、核酸酶(1)核酸酶Bal31(2)核酸外切酶Ⅲ(3)单链核酸酶S14、DNA甲基化酶T4多核苷酸激酶(Kinase)

作用原理：催化ATP的γ－