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小肽基因合成及其串联体表达载体的构建

摘要：以人表皮生长因子为研究对象，分3段合成了hegf基因片段，运

用套叠PCR技术进行连接，形成全长hegf(159bp)并克隆到酵母表达载体

pGAPZα-A中，利用同裂酶技术构建串联体表达载体，获得了分别含2、3、4拷

贝的串联体表达载体pGAPZα-2hegf、pGAPZα-3hegf和pGAPZα-4hegf,为下一步

进行基因表达及其生物学活性分析奠定了基础。

关键词：hegf基因合成；串联体；载体构建

表皮生长因子最初由Cohen及其同事从小鼠颌下腺分离得到，后在人尿中

分离得到，人表皮生长因子(hEGF)是由53个氨基酸组成的小分子多肽，含有3

个链内二硫键，结构稳定，研究表明，hEGF具有多种生物学功能，它通过与细

胞膜上hEGF受体结合，促使细胞内部发生一系列复杂的生化级联反应而发挥生

理作用，如它可促进细胞分裂，修复皮肤创伤、胃肠溃疡、角膜损伤等；防止皮

肤衰老，起到美白嫩肤的作用；靶向性结合含高密度hEGF受体的肿瘤组织，大

剂量的EGF还能抑制某些癌细胞的生长，商品化的hEGF具有很高的市场价值，

且市场需求量大，提高其表达量及生物学活性可广泛用于临床，满足市场的需要。

利用基因重组技术是大量制备活性多肽的有效方法，通常将少于100个氨基

酸的肽称为小分子多肽，由于其相对分子质量较小，在体内易被迅速水解，半衰

期短，因此在克隆、表达等都会碰到不少困难，本研究利用套叠PCR技术合成

了hegf基因，在构建酵母分泌型表达载体时，采取多拷贝串联构建，并在各拷

贝间引入kex2蛋白酶切位点，以便在毕赤氏酵母中表达时能切割形成单个的

hEGF分子，本研究探索了基因合成方法和小分子多肽表达载体构建策略，为实

现小分子多肽在体外的高效表达提供了参考依据，并为hEGF在酵母中串联表达

奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1质粒和菌株

菌株E.coliDH5α由本室保存，菌株ToplOF’、载体pGAPZα-A购自Invitrogen

公司，pMD18-Tvector购自TaKaRa公司。

1.1.2生化试剂

Taq聚合酶、T4-DNA连接酶、XhoI、XbaI购自TaKaRa公司，AvaⅢ、Pst

I购自Fermentas公司，DNAMaker购自Tiangen公司，UNIQ-10柱式DNA胶回

收试剂盒购自生工生物工程(上海)有限公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3基因片段与引物

选用毕赤酵母偏爱密码子，根据NCBI上报道的序列(E02089)分3段合成hegf

基因：1)hegf基因片段１(hegfl)：aactccgactctgaatgcccgctgtcccacgatggttactgc

ctgcacgacggcgtttgtatg；2)hegf2：ctgccgcaaacatacatatagctccgcgacctgtttata

cgcacattgacacatcatccgatg；3)hegf3：tgtgtagtaggctacatcggcgaacgctgccagtac

cgtgacctgaaatggtgggaactgcgc；4)引物l(P1)：gctcgagatgcataagagaaactccgactct

g；5)引物2(P2)：tgtagcctactacacagttac；6)引物3(P3)：ttctagactgcaggcgcagttc

teacc.hegf2片段划线部分分别与hegf1和hegf3划线部分互补，引物P1和P3分

别引入XhoI和XbaI酶切位点，基因片段及引物均由生工生物工程(上海)有限公

司合成。

1.2方法

1.2.1套叠PCR连接egf1和egf2基因片段

利用egf1和ear2部分互补及引物P1和P2，在同一个PCR反应中，采用不

同的退火温度，先使egf1和egf2延伸，再用P1和P2进行扩增，得到egf1-ear2

片段，PCR程序如下：94℃5min；94℃30s，41℃30s，72℃30s，10个循环；94℃

30s，5