DB14∕T 1403-2017 黄芩种子I∕TS2 序列鉴定方法.docx

ICSB05

65.020.20

65.020.20

DB14

山西省地方标准

DB14/T1403—2017

黄芩种子ITS2序列鉴定方法

2017-05-30发布2017-07-30实施

山西省质量技术监督局

发布

I

DB14/T1403—2017

目次

前言 II

1范围 1

2规范性引用文件 1

3术语和定义 1

4原理 1

5试剂与材料 1

6黄芩种子ITS2序列特征 3

7种子扦样 3

8种子处理 3

9种子DNA提取方法 3

10扩增与测序 4

11序列拼接 4

12结果判断 5

参考文献 6

II

DB14/T1403—2017

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山西农业大学提出并归口。

本标准起草单位：山西农业大学。

本标准主要起草人：宋芸、乔永刚、冯前进、刘根喜、王立。

1

DB14/T1403—2017

芩种子ITS2序列鉴定方法

1范围

本标准规定了黄芩种子ITS2序列鉴定的术语和定义、原理、试剂与材料、黄芩种子ITS2序列特征、种子扦样、种子处理、种子DNA提取方法、扩增与测序、序列拼接与结果判断。

本标准适用于黄芩种子ITS2序列鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。3.1

ITS2序列

在黄芩的rDNA基因中，5.8SrDNA和28SrDNA基因间隔序列称为内部转录间隔区2(ITS2)。

4原理

由于不同植物物种的ITS2核苷酸序列有差异，而同一物种不同植株间ITS2核苷酸序列保守，因此可以采用PCR扩增与测序技术对黄芩与非黄芩种子进行判断。

5试剂与材料

5.1琼脂糖

5.2抗坏血酸钠5.3β-巯基乙醇

5.4聚乙烯吡咯烷酮（PVP）

5.510g/L溴化乙锭（EB）溶液

称取1.0g溴化乙锭（EB），溶解于100mL水中。EB有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。

2

DB14/T1403—2017

5.610mol/L氢氧化钠溶液

称取400.0g氢氧化钠（NaOH），加800mL水溶解后，再加水定容到1000mL。5.71mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH8.0）

称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL水中，用盐酸（HCl）调pH至8.0，用水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃)条件下灭菌20min。

5.8500mmol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）

称取186.1g，乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2），加入700mL水中，加入适量氢氧化钠溶液（5.6），加热溶解后，冷却至室温，再用氢氧化钠溶液（5.6）调pH至8.0，用水定容到1000mL。在103.4kPa（121℃)条件下灭菌20min。

5.95mol/L氯化钠溶液

称取292.2g氯化钠（NaCl），加800mL水溶解后，再加水定容到1000mL。在103.4kPa（121℃)条件下灭菌20min。

5.102%CTAB提取液

量取1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（5.7）100mL，5mol/L氯化钠溶液（5.9）280mL，500mmol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（5.8）40mL和20gCTAB，溶解后，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃)条件下灭菌20min。

5.11TE缓冲液（pH8.0）

分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（5.7）和2mL乙二铵四乙酸二钠溶液（5.8），加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃)条件下灭菌20min。

5.12酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）溶液

按体积比为25:24:1配制酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）5.1350×T