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蓝舌病病毒抗体检测竞争酶联免疫吸附法

1范围

本标准规定了检测蓝舌病病毒抗体的竞争酶联免疫吸附试验及试剂制备方法。

本标准适用于蓝舌病病毒抗体检测、流行病学调查和免疫监测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

SN/T2123出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范

《中国兽药典》第三部附录

3.检测原理

酶联免疫吸附试验是由酶分子与抗体分子共价结合形成酶标记抗体，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。通过此种酶标记抗体与吸附在固相载体上的抗原发生特异性结合，当加入底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，从而出现显色反应，此种显色反应可通过酶标仪进行定量测定，从而通过底物的显色反应来判定有无相应的免疫反应。本标准中被检血清和蓝舌病病毒VP7蛋白特异性单克隆抗体先后加入已用蓝舌病病毒VP7蛋白包被的96孔酶标板孔内，二者竞争与孔内特异性包被抗原结合，加入酶标辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，洗涤后，然后加入底物显色。待检血清中蓝舌病病毒特异性抗体含量越高，则特异性单克隆抗体与包被抗原结合的就相对少，显色越浅；反之，显色越深。使用酶标仪测定反应物的OD450值，计算抑

制百分率（PI），根据PI值判定试验结果。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

AcNPV：苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒。

BT：蓝舌病。

BTV：蓝舌病病毒。

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BTVVP7：蓝舌病病毒的VP7内壳蛋白。

c-ELISA：竞争酶联免疫吸附试验。

ELISA：酶联免疫吸附试验。

HRP：辣根过氧化物酶。

McAb：单克隆抗体。

McAb-BTVVP7：蓝舌病病毒VP7蛋白特异性单克隆抗体。

OD：光密度。

PI：抑制百分率。

r/min：转速单位，转/分。

SDS：十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

5试剂和材料

a)包被液、洗涤液、稀释液、底物液、终止液,配制方法见附录A。

b)包被抗原为蓝舌病病毒VP7蛋白。

c)BTVVP7蛋白特异性单克隆抗体。

d)标准血清：蓝舌病病毒阳性血清对照品、弱阳性血清对照品、阴性血清对照品，由世界动物卫生

组织（OIE）参考实验室或中国农业部指定实验室提供。

e)辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（羊抗鼠IgG-HRP）。

f)96孔酶标板。

6主要设备

酶标仪。

单通道、多通道可调微量移液器。

恒温箱。

ELISA洗板机。

二氧化碳培养箱。

紫外分光光度计。

超声波破碎仪。

7BTVVP7重组蛋白抗原的制备

7.1种毒

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携带BTVVP7基因的重组杆状病毒AcNPV-BTV-VP7株，由深圳市检验检疫科学研究院动植检研究所构

建、鉴定、保管和供应。

7.2种毒的品质和检验

7.2.1蚀斑试验测定病毒含量

7.2.1.1用SF-900培养基重悬sf9昆虫细胞，调整细胞浓度为5×105个细胞/mL，加入6孔板，2mL/

孔，28℃培养24h；用SF-900培养基洗涤细胞2次。

7.2.1.2取6.1中的种毒病毒液，用SF-900培养基作10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8病毒稀释液，加入6.2.1.1中已长成单层细胞的6孔板，1mL/孔；28℃孵育1h，弃去培养板中病

毒液，加入于40℃水浴预热的含4%琼脂糖的2×SF-900培养基，28℃培养7～10d，观察计数蚀斑。

7.2.1.3按照病毒滴度=蚀斑数×病毒稀释倍数/每孔体积数进行计算；病毒含量应≥1.0×106pfu/mL。

7.2.2病毒表达蛋白量测定

7.2.2.1将保存的重组杆状病毒AcNPV-BTVVP7种毒病毒液，按1：10比例接种于长成单层的sf9昆虫

细胞，在SF-900培养基中28℃培养96～120h，反复冻融3次，即为病毒液。

7.2.2.2取100μL病毒液，加100μL2×SDS凝胶加样缓冲液，混匀后100℃煮沸5min，经12%SDS、考马斯亮兰染色、脱色液脱色后观察，可在39ku处观察到BTVVP7蛋白的表达条带。

7.2.3表达蛋白的抗原特异性

取培养的病毒液，SDS电泳，用羊抗BTV多克隆抗体和HRP标记的兔抗羊IgG进行Westernblot试验，在39ku处出现特异性反应带。与蓝舌