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藜麦霜霉病种子带菌检测方法

1范围

本标准规定了藜麦霜霉病种子带菌的检测方法的术语和定义、原理、仪器与用具、试剂、对照设

置、洗涤检验与分子生物学检测。

本规程适用于藜麦种子中霜霉病菌的检测。

2术语和定义

2.1藜麦霜霉病

藜麦霜霉病是由卵菌们霜霉属Peronosporavariabilis引起的一种重要的叶部病害，在藜麦不同生育期均可发生。典型症状为叶正面形成不规则淡黄色或粉红色病斑，叶背面灰色、淡粉色、深灰色的霉层，从下部叶片开始发病，发病严重时整个叶片从叶柄处脱落，整株枯死，流行年份常导致藜麦减产与品质下降。田间通过气流传播，病原菌主要以卵孢子和孢子囊在藜麦种子或土壤里越冬。（藜麦霜霉病症状及病原菌形态见附录）

2.2TD-PCR

即touchdownPCR，降落PCR。指每一个（或n个）循环降低1℃（或n℃)退火温度，直至达到一个较低的退火温度（touchdown退火温度）。然后以此温度进行10～15个循环。正确和非正确退火温度1℃差异将造成PCR产物量4倍的差异，如果相差5℃,就会产生4的五次方(1024)倍的优势，因此，相对于非正确产物，正确产物可以得到富集。退火温度起始在高于计算Tm值的15℃左右，以后随着循环依次降低，直到Tm值以下5℃,当达到特异的引物-模板结合的Tm值时，扩增就会开始。当退火温度降到非特异扩增发生的水平时，特异产物会在与非特异扩增的竞争中胜出，成为主导的扩增产物，从而可以避免非特异扩增产物的出现。

3原理

种子带菌是藜麦霜霉病的主要初侵染源，山西省藜麦霜霉病的病原为Peronosporavariabilis。采用带菌种子洗涤检验的方法，对藜麦种子洗涤液中病原菌卵孢子、孢子囊的形态特征进行初步鉴定；利用Peronosporavariabilis的特异引物PV6对病菌进行DNA扩增，获得其特异DNA片段，实现对该病原菌的快速检测和准确鉴定。

4仪器和用具

4.1主要仪器

电子天平、旋涡振荡器、离心机、光学显微镜、核酸提取仪、高速冷冻离心机、PCR扩增仪，电泳装置、凝胶成像系统、高压灭菌锅、微量移液器等。

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4.2主要用具

量筒、烧杯、三角瓶、离心管、吸管、载玻片、盖玻片、PCR管、移液器吸头，所有器具高压蒸汽121℃灭菌30min。

5试剂

5.1基本要求

所用试剂均为分析纯，水为灭菌去离子水。

5.2洗涤检验试剂

氢氧化钾（1M）、无菌去离子水。

5.3PCR试剂

a)真菌基因组抽提试剂盒、2×EasyTaqPCRSuperMix。

b)TBE电泳缓冲液

10×TBE存储液

取108gTris、55g硼酸和7.44gNa2EDTA·2H2O，加入约800mL去离子水充分搅拌溶解，定容至1000mL，室温保存。

0.5×TBE工作液

用去离子水将存储液稀释20倍，即为工作液。

c)扩增产物检测试剂

琼脂糖、Goldenview核酸染料。

5.4引物序列

PV6FGTTGCTGGTTGTGAAGGCTG

PV6RATGCTACGCAACCGAAGTCA

6对照设置

按以下进行对照设置：

a)以Peronosporavariabilis为阳性对照。

b)以健康藜麦种子为阴性对照。

c)以灭菌去离子水作空白对照。

7洗涤检验

取5g（约1300～1500粒）藜麦种子，放入盛有20mL无菌水的三角瓶内，震荡30min，洗涤附着在种子表面的病菌孢子，用无菌纱布过滤，滤液倒入无菌离心管中，4000rpm离心5min，倒掉上清液，加入5mLKOH（1M）浸泡16h后，震动离心管，使沉淀充分悬浮，取一滴悬浮液滴于载玻片上，光学显微镜下观察病原菌形态，每个样品至少镜检5个玻片。

8分子生物学检测

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8.1操作步骤

8.1.1提取DNA

a)取7离心后所得沉淀，于核酸提取仪中裂解，用真菌基因组抽提试剂盒提取疑似病原菌DNA，具体方法按试剂盒说明书操作。

b)用蛋白/核酸分析仪鉴定获得的DNA质量，要求A260/A280比值为1.8～2.0。

8.1.2PCR扩增

a)PCR反应扩增体系：20μL反应体系，包含上下游引物各0.25μM，DNA模板1μL及EasyTaqPCRSuperMix10μL，用无菌ddH2O补足。

b)TD-P