流式细胞术及其应用课件.ppt

样品培养细胞新鲜组织石蜡包埋单细胞悬液标记荧光抗体检测表型测定细胞分选流式细胞术操作流程统计学分析继续培养第二部分流式细胞术在不同领域的应用细胞周期分析

样品制备1000rpm5分钟收集2X106个细胞PBS漂洗两次70%酒精4度固定过夜收集固定的细胞PBS漂洗0.5PBS悬浮细胞2.5μl10μg/μlRNaseA37度消化1小时过300目细胞筛50μl0.1mg/mlPI（含1%Triton)，1000rpm5分钟离心两次混匀，室温静止5分钟上机第一部分流式细胞术的一般介绍概念流式细胞术（FlowCytometry，FCM）利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。流式细胞仪（FlowCytometer)集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。流式细胞仪特点单细胞悬液或生物颗粒分析速度高多参数精度高当代最先进的细胞定量分析技术FACSCalibur特点：光路调节系统固定自动化程度高操作简便使用寿命长配备1-2根激光细胞分选速度慢，主要用于细胞分析临床型（台式机）BDLSRFACSVantageDiVa科研型（大型机）特点：多数字化适用用各类细胞分选4路分选FACSAria科研型特点：分辨率高选配多种波长和类型激光器可把感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（4路和24孔板）适用于高速分选和多色分析流式细胞仪检测范围细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞结构特异性抗原（细胞表面/胞浆/核）细胞内细胞因子细胞活性酶活性激素结合位点细胞受体细胞功能临床研究淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、flow-FISH法测定端粒长度基础研究淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（MDR）、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究流式细胞仪的工作原理光学系统激光光源 光收集系统液流系统 流动室液流驱动系统电子系统 光电转换 数据处理系统细胞分选系统激光光源单波长、高强度、高稳定性多采用氩离子激光器或氦氖激光器一般选配2-4根激光，488nm、633nm和355nm、407nmUV激光最多检测13个荧光参数LongpassShortpassBandpass460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50光收集系统：滤光片光收集系统：光电倍增管（PMT）FACSCalibur光路图液流系统：流动室、液流驱动系统液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱细胞分选系统FluorescenceActivatedCellSorting488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector信号检测--散色光FSC（小角散射)光它反应细胞的相对大小和截面积的大小SSC(90度角散射光)代表细胞的颗粒度和精细结构的变化全血细胞流式FSC-SSC图它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同类型的细胞群加以区分信号检测--荧光信号自发荧光特异荧光特异荧光能量级激发激发态发射激光能量损失数据显示类型单参数直方图（Histogram）X轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用“通道数”表示，可以与光强度之间线性关系或对数关系Y轴：代表该通道内所出现具有相同光信号特征性细胞的频率二维等高图和密度图Pseu