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克隆载体表达载体构建详细版
一、稀释引物
1、4℃，15min、13000转离心（先等离心机降温）
2、根据OD值加DD水。
3、静置30min（冰上）
4、准备1.5毫升EP管，并加90ulDD水。
5、向EP管中加10ul引物，震荡离心，-20℃保存。
二、跑MIX检测引物（20ul体系）、
上引物0.8ul
下引物0.8ul
Mix10ul
DNA（日本晴）1ul
DD水7.4ul
三跑高保真酶（50ul体系）
DNAorCDNA2ul
上引物2ul
下引物2ul
5*buffer10ul
dNTPs5ul
DD水28ul
Pfu（最后加）1ul
四胶回收流程
1、在紫外线下切胶，用牙签装入2ml的EP管中。
2、按量加XP2，放在55℃水浴锅中10min，每2min摇匀1次，
涡旋，短离。
3、将液体冷却到室温，转移到平衡住中，离心10000转，
1min30s，倒掉滤液。
4、加入xp2300ul，离心10000r，1min30s，倒掉滤液。
5、加入spw700ul，离心10000r，1min，倒掉滤液（重复一次）
6、空转2min，13000r，之后换1.5mlEP管。
7、套上保鲜膜放入37℃烘箱中，30min。
8、加入DD水10ul，静置2min，离心2min，13000r，重复3
次，-20℃保存。
五、胶回收产物检测（10ul）体系
上引物0.4ul
下引物0.4ul
Mix5ul
回收产物1ul
DD水3.2ul
六、构建bluntcloning载体（克隆载体）（4ul体系）
胶回收产物3.5ul
Bluntcloning0.5ul
混匀后，PCR：25℃15min盖子温度50℃
之后转化
1、提前5min从-70℃冰箱中拿出大肠杆菌感受态，冰上解冻
5min。
2、将样品（4ul）加入感受态的大肠杆菌中，冰上30min，大约
剩5min左右，打开水浴锅预热到42℃，并拿出SDC培养基解冻（室
温解冻）。
3、水浴锅42℃，60-90s迅速转移到冰浴2min，该过程中不要
摇动离心管。
4、加入900ulSOC培养基，混匀。
5、37℃，160r摇床1h，使细菌复苏。
6、取出后离心3000r，2min。
7、吸出上清，留下100-150ul左右冻在LB100ml+kana或者A
固体培养基上。
8、涂板，37℃过夜培养。
9、挑单菌落（一般不超过7个）加入到10ul的DD水中。
菌液PCR体系（10ul体系）
上游引物0.4ul
下游引物0.4ul
Mix5ul
菌液1ul
DD水3.2ul
之后跑电泳，若有目的条带则继续。
七摇菌
菌液+LB液体（加抗生素）L管（过夜摇菌）
第二天500ul菌液+500ul甘油混匀保存2管，其中一管送检，另
一管-70℃保存。
若检测结果正确
八、提取质粒
1、在1.5ul的EP管中收集菌液，10000转，1min，弃上清，重
复一次。
2、加205ulsolutionI（提前预热），用枪头打匀，室温静置
2min。
3、加250ulsolutionII（提前预热），混匀，室温静置2min。
4、加350ulsolutionIII，混匀，室温静置2min（有白色丝状物
产生）
5、13000转，10min，取700
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