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8。大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化

大肠杆菌表达系统遗传背景清楚,目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点，是分子生物学研究和生物技术

产业化发展进程中的重要工具.因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必

要的.本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点,归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细

操作步骤，并且结合笔者的操作经验,总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。

8.1大肠杆菌表达系统的选择与构建

8.1。1表达载体的选择

λPLcspAIPTG

根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如，等和另外一类就是广泛使用的诱导的启

lactrctacT5/lacoperatorT5/lacoperator

动子,如，，，，等.根据表达蛋白质的类型可分为单纯

NC

表达载体和融合表达载体。融合表达是在目标蛋白的端或端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性,促进蛋白的正确折叠，

Poly—ArgPoly

实现目的蛋白的快速亲和纯化,或者实现目标蛋白的表达定位。常用的用于亲和纯化融合标签包括,

—His,Strep—TagS—tagMBPHis—TagGST-TagHis

Ⅱ，，等.其中和是目前使用最多的。

2+2+2+2+

Tag大多数是连续的六个His融合于目标蛋白的N端或C端，通过His与金属离子：CuFeZnNi的

Ni2+HisNC

螯合作用而实现亲和纯化，其中是目前使用最广泛的。标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的端和端不

影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。目前常使用的表达载体主要是由Novagen提供的pET系列和

Qiagen公司提供的pQE系列。

HisS—

除了标签外，还原性谷胱甘肽转移酶是另一种实验室常用的融合标签.它可以通过还原性谷胱甘肽琼脂糖亲和层析

HisGST

而快速纯化.此外，与相比，很多时候能够促进目标蛋白的正确折叠,提高目标蛋白表达的可溶性，因此，对于那

hisGSTGST26kDa

些用标签表达易形成包涵体的蛋白，可以尝试用融合表达来改进。当然，具有较大的分子量（）,

GSTGSTGEHealthcare

可能对目的蛋白的活性有影响,因此很多时候切除是必须的。目前，融合表达系统主要是由

Amersham

（原)提供。

8。1.2宿主菌的选择

E。coliDH5