原核蛋白包涵体表达案例 .pdfVIP

原核蛋白（包涵体）表达案例

原核蛋白（包涵体）表达案例

1.实验目的

以客户提供的目的蛋白基因构建表达载体，通过原核蛋白表达体系获得目的蛋白

A。

2.实验设计

（1）分析客户提供的目的蛋白序列，设计蛋白表达方案；

（2）选择钟鼎特色载体pCzn1，构建表达质粒pCzn1-A；

（3）IPTG诱导进行目的蛋白表达，并且优化表达条件，将诱导条件调整至37℃，

经分析目标蛋白主要呈包涵体形式，通过WesternBlot检测蛋白A是否表达；

（4）通过Ni柱纯化获得目的蛋白A，SDS检测纯化蛋白纯度，BSA方法

测定蛋白浓度。

3.蛋白分析

（1）经EditSeq翻译目的蛋白A序列：m.w.=23.25kd，pI=5.22

（2）经UniProt匹配，蛋白A物种来源：人类

（3）蛋白性质分析

蛋白亲疏水分析

蛋白跨膜结构域分析

蛋白信号肽预测

分析结果：

目的蛋白整体呈亲水性、无跨膜结构域、无信号肽序列，可尝试全长表达。

结论：将目的基因构建在钟鼎特色载体pCzn1上，利用载体自带信号肽分泌表

达。

4.表达载体构建

4.1pCzn1-A质粒酶切验证：

酶切鉴定

钟鼎特色载体pCzn1Marker:200,500,800,1200,2000,3000,4500

Line1:酶切前质粒

Line2:酶切后质粒

基因名称：A（OD260/OD280:1.82）

酶切位点：NdeI/XhoI

4.2pCzn1-A质粒测序验证：

部分序列比对结果图

5.蛋白表达及纯化

蛋白表达鉴定SDS分析

蛋白纯化SDS分析

M:蛋白质分子质量标准

M:蛋白质分子质量标准

1:未诱导

1:破碎后处理样品

2:诱导后

2:流出

3:诱导破碎后上清

3:洗脱

4:诱导破碎后沉淀

蛋白WesternBlot鉴定分析

M:蛋白质分子质量标准

1:纯化后样品

6.实验结论

目的蛋白A在IPTG诱导下进行包涵体形式表达，蛋白表达成功。