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结直肠癌中KRAS基因突变及意义

丁莉;韩义明;郑杰;沈金花;邹先进

【摘要】目的观察结直肠癌患者的KRAS基因突变,探讨其生物学意义.方法收集

湖北省荆门市第一人民医院2012年9月～2015年7月以双脱氧末端标记法行

KRAS基因测序的结直肠癌根治标本378例,分析KRAS基因12/13密码子基因状

态.结果378例标本中,KRAS基因12/13密码子野生型247例,突变型131例

(34.7％).KRAS基因突变与患者年龄、性别无关;密码子G12突变率在有淋巴结转

移组中较高,而G13突变与淋巴结转移无关.实验共检测到8种突变类型,以G12D、

G12V、G13D三种类型最多,G12F(GGT＞TIT)为罕见突变类型.结论KRAS基因

突变的机制尚不明确,测序法能够判读少见的突变类型,有利于精准化治疗.

【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》

【年(卷),期】2016(032)010

【总页数】4页(P1156-1159)

【关键词】结直肠肿瘤;测序;KRAS基因状态;G12F

【作者】丁莉;韩义明;郑杰;沈金花;邹先进

【作者单位】湖北省荆门市第一人民医院病理科,荆门448000;湖北省荆门市第一

人民医院病理科,荆门448000;湖北省荆门市第一人民医院病理科,荆门448000;中

山达安基因有限公司,广州510665;湖北省荆门市第一人民医院病理科,荆门

448000

【正文语种】中文

【中图分类】R735.3

我国结直肠癌年新发病例数高达15万，40%以上的结直肠癌患者确诊时肿瘤已经

发生转移而失去根治性手术治疗的机会，而常规化疗无法获得长期疗效。2015年

《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌指南》提出，结直肠癌患者应该进行全

RAS及BRAF基因突变检测。RAS基因家族的KRAS基因突变是结直肠癌的早期

事件，其在转移灶及原发灶中保持高度一致性[1]。检测KRAS基因状态，是结直

肠癌连续规范性治疗的基础。KRAS基因的2号外显子12/13密码子因突变率高、

突变方式多样化、药物治疗差异化备受关注。

1.1标本选取收集2012年9月～2015年7月荆门市第一人民医院行结直肠癌根

治术并应用测序法检测KRAS基因12/13密码子基因序列标本378例。

1.2试剂与仪器KRAS基因突变检测试剂盒(双脱氧末端标记法)为中山大学达安基

因股份有限公司产品，石蜡包埋组织DNA提取试剂盒为Qiagen公司产品，

SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒为上海生工生物公司产品。PCR仪为杭州博日

科技有限公司产品，测序仪为ABI公司产品(ABI3130)，DNA测定微量分光光度

计为广州飞迪生物科技公司产品(Nano-100)。

1.3石蜡包埋组织DNA提取对照HE染色切片，选取肿瘤细胞密集区进行打孔(组

织直径约0.5cm)，切取4～5μm厚石蜡包埋浸润性结直肠癌组织8片附于载玻

片上，65℃烤片30min，二甲苯脱蜡并梯度乙醇脱水，去离子水洗2遍。用盖

玻片将组织块轻轻刮至1.5mlEP管中，加入180μlATL缓冲液及20μl蛋白酶

K，涡旋混匀并置于56℃金属浴过夜。设置金属浴温度90℃维持1h将酶灭活，

然后加入200μlAL缓冲液及200μl无水乙醇并涡旋混匀。将所有液体一起加入

过滤柱中，8000r/min离心1min将DNA吸附至膜上，依次用AW1、AW2溶

液洗涤，13000r/min离心3min甩干，室温放置15min使滤过膜彻底干燥。

加入100μlATE缓冲液溶解DNA并13000r/min离心2min收集DNA，微量

分光光度计测定DNA浓度及质量(OD260/280)。

1.4KRAS基因12/13密码子测序取出试剂置于冰上融解，扩增PCR反应体系：

42μlPCR反应液+3μl聚合酶+(DNA+去离子水)=50μl，DNA