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NuclearProteinExtractionProtocol
BufferA:10mMHEPES,pH7.9for50ml,add500ul1MHEPES,pH7.9
O
2
Justbeforeuse,add50ul10%NP-40,20ul0.1MDTT/1mlbuffer,and1xproteaseinhibitor.
BufferB:20mMHEPES,pH7.9for50ml,add1ml1MHEPES,pH7.9
O
2
Justbeforeuse,add10ul0.1MDTT/1mlbuffer,and1xproteaseinhibitor.
1.Washplateswithice-coldPBStwice.
NP-40,1mMDTTand1xproteaseinhibitor(PI).
4.Harvestcelllysateswithacellscraper.
timestodisruptcellclumps.
6.Rotate10minat4C.
O
7.Centrifugeattopspeedfor3minat4C.
O
8.Savesupernatant(cytosolicfraction)ifdesired.Otherwisediscardthesupernatant.
9.Add500ulice-coldbufferA,votex10seconds.Spinattopspeedfor3minat4C.
O
1mMDTTand1xPI.Incubateoniceof30minwithintermittentSTRONGvortexing.
11.Spinfor15minattopspeedat4C.collectsupernatantandmeasuretheproteinconcentration
O
withBCAassay.Aliquottheextractandkeepin-80Cforfutureuse.
O
一，引物设计:
1,选择合适的载体。酶切位点及其顺序（酶切位点的顺序一定不能颠倒）。
2，在NCBI上再次确认目的片段的碱基序列。
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