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B细胞激活因子原核表达载体构建与纯化-

分子生物学论文-生物学论文

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B细胞激活因子（Bcellactivatingfactor,BAFF;又称

TNFSF13B,THANK,CD257,BLyS或TALL1）是1999年发现的肿瘤坏死

因子家族中的一员，是与人体免疫有关的细胞因子[1-3].BAFF由285

个氨基酸组成，其中1~46位氨基酸为胞内区，47~73位氨基酸为

疏水的跨膜区，74~285位氨基酸为胞外区。BAFF位于细胞内的N

端缺少信号肽，C端在胞外，属于Ⅱ型跨膜蛋白[1-2.BAFF主要表达在

先天免疫细胞如单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞及滤

泡树突细胞等。目前已知BAFF可与3种受体相互作用，分别是B

细胞成熟抗原（Bcellmaturationantigen,BCMA）[4-5]跨膜激活物与

亲环素配体相互作用因子（transmembraneactivatorandCAML

interactor,TACI）[6]及BAFF受体（BAFFreceptor3,BAFF-R,也叫

BR3）[7].其中，BR3是BAFF的特异性受体，而TACI和BCMA同样

也是TNF超家族的另一成员APRIL的受体。BR3是唯一可被可溶性

sBAFF三聚体激活的受体。同许多TNF家族成员一样，sBAFF多以

三聚体型式存在，与其受体相互作用，实现其生物学功能[8].在中性

或碱性条件下，20个三聚体型式的sBAFF可通过其Flap区相互结合，

形成类似病毒颗粒的60聚体型式，并可在酸性条件下发生不可逆的

分离[9-10].BAFF的Flap环为其特有，其他TNF家族蛋白没有此结构。

三聚体形式的配体与其受体结合并不一定会激活下游信号通路，尤其

是对于TACI,只有60聚体形式的BAFF才能激活它介导的生物学效

应[11].

研究发现，BAFF的异常表达与自身免疫性疾病密切相关。

BAFF表达量的高低影响到B细胞的存活信号通路及产生自

身抗体的B细胞的选择性凋亡[12].普遍认为BAFF过表达与系统性

红斑狼疮（systemiclupuserythematosus,SLE）、类风湿性关节炎

（rheumatoidarthritis,RA）、干燥综合征（Sjgrenssyndrom,SS）

等多种自身免疫性疾病的发生和发展有着密切关系[13-14].因此BAFF

及其受体有望成为治疗相关性疾病的新靶点。BAFF可溶性形式为其

发挥功能的主要区域，故本研究旨在对BAFF胞外区可溶性片段134

~285位氨基酸残基进行克隆，构建原核表达载体。通过IPTG导蛋

白表达，经纯化及复性得到目的蛋白，为体外研究sBAFF的结构与

功能关系以及进一步探讨其生物学功能奠定基础，并为以BAFF与其

受体为靶点的药物设计提供新思路。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1菌种和质粒：质粒pET21a;大肠杆菌E.coliTop10,E.

coliBL21（DE3）均由本实验室保存。

1.1.2试剂及耗材：DNA限制性内切酶NdeI、XhoI,T4DNA

连接酶、DNAMarker购自Takara公司；KODDNAPolymerase购

自东洋纺（上海）生物科技有限公司；DNA凝胶回收试剂盒、质

粒小量提取试剂盒购自申能生物工程公司；蛋白胨、酵母浸膏购自

Sigma公司；IPTG购自Sunshine公司；丙烯酰胺和双甲叉丙烯酰

胺、TEMED购Bio-Rad公司；Ni2+-NTAagarose购自Qiagen公司；

透析袋购自南京晚晴公司（MW8-10kDa）;相关引物由南京金斯

瑞生物技术公司合成。

1.1.3实验仪器：高速离心机（CR22E,日本HITACHI公

司）,超声波细胞破碎仪（SCIENTZ-IID,宁波新芝生物科技股份有限

公司）,恒流泵（BT-100,上海沪西分析仪器厂