电泳分离蛋白质与蛋白质免疫印迹.ppt

关于电泳分离蛋白质与蛋白质免疫印迹蛋白免疫印迹杂交（WesternBlot）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。第2页,共28页，星期六，2024年，5月原理

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂N，N，N?，N?—四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。第3页,共28页，星期六，2024年，5月第4页,共28页，星期六，2024年，5月第5页,共28页，星期六，2024年，5月第6页,共28页，星期六，2024年，5月30%丙烯酰胺的配制1、称量Acrylamide290g，Bis10g，置于1L烧杯中2、向烧杯中加入约600ml的去离子水，充分搅拌溶解。3、加去离子水将溶液定容至1L，用0.45mm滤膜滤去杂质。4.于棕色瓶中4℃保存。注意：丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套、口罩等。聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成份。第7页,共28页，星期六，2024年，5月凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。表3.4分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 蛋白质?10KD 20-30 1O-40KD 15-201O-100KD 10-15 100KD 5-10 ?500KD 2-5 第8页,共28页，星期六，2024年，5月分离胶的聚合（12%）5ml体系蒸馏水1.634ml30%丙烯酰胺2.0ml1.5MpH8.8Tris-SDS 3.7ml10%AP25ulTEMED5ul上层加异丙醇压胶，室温一小时第9页,共28页，星期六，2024年，5月积层胶的聚合（5%）2.5ml体系蒸馏水1.75ml30%丙烯酰胺0.413ml1MpH6.8Tris-SDS0.338ml10%AP12.5ulTEMED2.5ul室温一小时第10页,共28页，星期六，2024年，5月第11页,共28页，星期六，2024年，5月过程图

48/newkj/my/moban2/index.htm第12页,共28页，星期六，2024年，5月（二）方法1、制胶：制备凝胶板，将混合后的分离胶溶液，用1ml枪加至距梳齿下缘约1cm。用1mL枪在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层异丙醇(约高3–4mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。约30-60min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。将异丙醇倒去用重蒸水洗净胶面，将混合均匀后的浓缩胶溶液加入分离胶上方，轻轻插入梳子.待上层胶聚合，拔出梳子，放入电泳槽，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.3cm，即可加样。2、样品处理：样品经反复冻融裂解，离心，测浓度后，向样品中加入适量的上样缓冲液6*SDS，金属浴105°C10min，加样量一般每个样品池10~40?l。第13页,共28页，星期六，2024年，5月3、电泳将电泳仪与电源接通，打开电泳仪稳流，开始时电流约20mA，待样品进入分