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原核表达及蛋白质的纯化

原核表达及蛋白质的纯化与浓度测定

之一原核表达

一(实验材料

1.大肠杆菌BL21.DH5a

2.高盐LB:蛋白胨10g，酵母浸出物5g，NacL10g(低盐LB为5g)，溶于双蒸

水，然后定容至1000ml中，121.6?高压灭菌25min-30min后备用

3.LB固体培养基:按上述方法配制的液体培养基，每100ml加1.5g琼脂粉，高

压灭菌25min-30min，待培养基温度降至常温左右时(一般为不烫手即可)，在无菌

状态加入抗生素(3g/200ml)并铺平板，冷却凝固后放入4?备用

4.IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):在8ml蒸馏水中溶解2gIPTG后，用蒸

馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20?，这时

配好的

。IPTG浓度为0.8m/mL

5.氨苄青霉素(ampicillin)(100mg/ml):溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水

中，最后定容至10ml。分装成小份于-20?贮存。常以25ug/ml,50ug/ml的终浓度

添加于生长培养基。

6.卡那霉素(carbenicillin)(50mg/ml):溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量

的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20?贮存。常以25ug/ml,50ug/ml的终

浓度添加于生长培养基。

7.考马斯亮兰染色液:称取1g考马斯亮蓝R-250,置于1L烧杯中，量取250mL

的异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解。加入100mL的冰乙醋酸，均匀搅拌。加入

650mL的去离子水，均匀搅拌。用滤纸出去颗粒物质后，室温保存。

8.考马斯亮兰脱色液:量取下列溶液，醋酸(冰乙酸)45mL;甲醇50mL;dH2O

10mL,充分混合后使用。

9.10%过滤酸铵:把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中，该溶液可在

4?保存数周。

10.5×Tris-GlycineBuffer(SDS电泳缓冲液)配制方法:称取下列试

剂，置于1L烧杯中。Tris15.1g;Glycine94g;SDS5.0g;加入约800mL的去离

子水，搅拌溶解。加去离子水将溶液定容至1L后，室温保存。

二(实验原理

大肠杆菌是重要的原核表达体系,在重组基因转化入大肠杆菌菌株以后，通过

温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS以检

测表达蛋白质。实验室常采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔(IPTG)诱导外源基因表

达，不同

的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况

而定。三(操作程序及结果判定

(一)构建重组表达载体

1、载体酶切:将原核表达载体(例如:pET-28a)用限制性内切酶(同引物的酶切

位点)进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收试剂盒回收所需要的载体

大片段。

2、PCR产物双酶切后经DNA纯化与回收试剂盒(或者切胶回收)回收后，同样在

用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶

回收试剂盒回收所需要的片段。

注:一般需要先连T载体克隆增值，然后再连原核表达载体。

(二)获得含重组表达质粒的表达菌种

1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志(抗Amp或kan)作筛

选，挑取单斑，用小提试剂盒抽提质粒，双酶切初步鉴定。

2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架(有无因为碱基的缺失所造成的移

码)，如果均正确，进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至

不同酶切位点。

3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞(如BL21)。

(三)诱导表达

1、挑取含重组质粒的菌体单斑至5ml低盐LB液体培养基中含Amp或kan中37?

过夜培养。

注:A.同时做空载体(如pET28a)的诱导作为对照;本实验室常用的Amp或Kan，

若为A100(100mg/ml)的话5mLLB加5微升，若为K50(50mg/ml)的话5mLLB也加

入5微升。

B.接种表达和接种做感受态都类似，一定要用挑单克隆、加足量抗生素、过夜

培养的新