一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法 .pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利说明书

(10)申请公布号CN102827860A

(43)申请公布日2012.12.19

(21)申请号CN201210286769.5

(22)申请日2012.08.13

(71)申请人安徽大学

地址230601安徽省合肥市经济技术开发区九龙路111号

(72)发明人童望宇陈昭元谢丽

(74)专利代理机构安徽合肥华信知识产权代理有限公司

代理人余成俊

(51)Int.CI

C12N15/70

C12N1/21

C12R1/19

权利要求说明书说明书幅图

(54)发明名称

一种用于重组蛋白分泌型表达的双

基因突变大肠杆菌的构建方法

(57)摘要

本发明公开了一种用于重组蛋白分

泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方

法使用预先设计的细胞膜蛋白和细胞壁合

成酶基因的双敲除基因的引物进行PCR反

应，得到两端为10～250bp特定目标基因

同源序列及中间为抗性标记序列的双敲除

基因的基因打靶片段，并分别通过电转化

整合到宿主大肠杆菌染色体中，得到双基

因突变的分泌型大肠杆菌菌株。本发明提

高重组外源蛋白的表达，降低目标蛋白的

胞内降解；减少重组外源蛋白的胞内积

累，消除了包涵体的形成；取消了细胞破

壁工艺，降低了热原，简化了分离纯化；

进而达到降低生产成本，提高蛋白表达和

产品质量的目的。

法律状态

法律状态公告日法律状态信息法律状态

权利要求说明书

1.一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法，其特征在于：

使用预先设计的细胞膜蛋白和细胞壁合成酶基因ipal/i和imrcB/i，或

imrcB/i和ilpp/i的双敲除基因或其他基因组合的双敲除基因的引物进行

PCR反应，得到两端为10～250bp特定目标基因同源序列及中间为抗性标记序列

的浓度为1～1000ng/μl的ipal/i和imrcB/i，或imrcB/i和

ilpp/i的双敲除基因或其它基因组合的双敲除基因的基因打靶片段，并分别通

过电转化整合到宿主大肠杆菌染色体中，得到双基因突变的分泌型大肠杆菌菌株；

所述的其他基因组合指的是imrcA/i，imrdA/i，irodA/i，

imurC/i，irodZ/i中任意两个的组合。

2.根据权利要求1所述的一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构

建方法，其特征在于：所述的双基因突变的分泌型大肠杆菌菌株含有的基因

ipal/i和基因imrcB/i编码区发生了突变，或者基因ipal/i和基因

imrcB/i的启动子区域发生了突变，从而使ipal/i基因和基因imrcB/i无

法表达出相应Pal和MrcB蛋白产物，或表达出降低了功能的Pal和MrcB蛋白产

物，进而正常的细胞膜运输功能发生变化。

3.根据权利要求1所述的一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构

建方法，其特征在于：

所述的双基因突变大肠杆菌的应用包括：外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株

构建、分泌型重组大肠杆菌的目标蛋白表达过程；

所述的外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株构建方法为：将外源目标蛋白质基

因先重组到分泌型质粒pET32a(+)中，随后克隆到所述的双基因突变的分泌型大肠

杆菌菌株中，进而得到外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株。

4.根据权利要求3所述的一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构

建方法，其特征在于：所述的外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株含有编码外

源蛋白的重组基因质粒，该重组质粒中外源蛋白基因与定位于周质空间的信号肽编

码序列相连，从而使胞内合成的外源蛋白通过信号肽导入于周质空间进而渗漏到培

养基中。

5.根据权利要求3所述的一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构

建方法，其特征在于：所述的分泌型重组大肠杆菌的目标蛋