传染性造血器官坏死症活载体疫苗的研制 .pdfVIP

传染性造血器官坏死症活载体疫苗的研制

传染性造血器官坏死症(Infectioushematopoieticnecrosis,IHN)是由传

染性造血器官坏死症病毒引起的一种鲑鳟鱼类以肾脏和脾脏等造血组织坏死为

主要特征的高度接触性传染病。该病的病原为传染性造血器官坏死症病毒

(Infectioushematopoieticnecrosisvirus,IHNV),是一种负链RNA病毒,隶属

弹状病毒科诺拉弹状病毒属。

IHN主要危害鱼苗和种鱼,发病鱼死亡率通常在90%以上,是鱼类口岸第一类

检疫对象,被我国列为二类动物疫病。IHN给北美、欧洲和亚洲等各国鲑鳟鱼养

殖业造成了毁灭性的打击,严重阻碍了各国水产养殖业的发展。

我国于1990年在辽宁暴发IHN,死亡率近100%。近几年来,随着我国养鳟业

的迅速发展,深入研究IHNV对于更好的防控此病具有重要的现实意义。

本研究,通过建立IHNV的分离、鉴定方法,并克隆IHNVG基因,以腺病毒作

为外源目的基因的转移载体,旨在构建表达IHNVG蛋白的重组腺病毒载体,带有

IHNVG基因的重组腺病毒及IHN活载体疫苗的安全性试验,最佳使用剂量的确定

试验,效力试验,免疫持续期和保存期研究,为下一步对传染性造血器官坏死症更

好的防控奠定了坚实的基础。1.为对甘肃省某虹鳟鱼养殖场爆发疑似传染性造血

器官坏死病(IHN)进行病原的分离与实验室鉴定。

通过在适当的细胞系(RTG-2细胞、CHSE-214细胞和EPC细胞)分离病毒,再

进行RT-PCR和PCR技术扩增传染性造血器官坏死症N基因,将N基因与克隆载体

pMD-19T连接,转化至大肠杆菌中通过PCR扩增鉴定该病毒。结果显示,病料经研

磨过滤除菌的悬液分别接种虹鳟鱼性腺细胞(RTG-2)、大鳞大麻哈鱼胚肾细胞

(CHSE-214)和鲤鱼上皮瘤细胞(EPC),均可出现典型的细胞病变效应(CPE),对该

病毒的N基因进行特异性的扩增,扩增出了预期的786bp大小的片段,与已经发

表的IHNV代表性毒株LB91KI株、RB76株、HV-7601株及HLJ-09株的N基因相

对区域的核苷酸序列进行比较,同源性分别为99%,99%,97%和96%。

推导的氨基酸的同源性分别为99%,97%,96%和98%。使用MEGA软件构建系统

进化树,系统进化树分析显示,分离株与美国毒株JB91KI、RB76,中国毒株HLJ-09、

及日本毒株株HV7601的遗传关系较近。

结果表明,爆发的疫病为传染性造血器官坏死症,其病原为传染性造血器官

坏死症病毒,将其命名为ihnvgs株。2.为克隆传染性造血器官坏死症(ihnv)g基

因,构建传染性造血器官坏死症(ihn)g基因重组腺病毒载体,为ihn的预防及疫

苗的研制提供参考。

通过rt-pcr和pcr技术扩增传染性造血器官坏死症g基因,将g基因插入到

腺病毒穿梭载体,带有目的基因的腺病毒载体与骨架载体在大肠杆菌bj5183中

同源重组构建重组腺病毒质粒,通过pcr扩增及salⅠ和xhoⅠ双酶切鉴定正确后,

经pacⅠ酶切后转染hek-293细胞进行包装,获得带有目的基因的重组腺病毒,通

过观察绿色荧光来监控重组腺病毒,用western-blot法检测g蛋白的表达,并测

定重组腺病毒的tcid50。结果显示,成功克隆出ihnvg基因,长度为1533bp,分离

的ihnvgs株与毒株ihnvchyu78、chab76、komo71、rtnaq82和hv7601株的同源

性为99%。

系统进化树分析显示,ihnv分离株与韩国毒株chyu78、chab76、美国毒株

auke77及blk94遗传关系较近。成功构建了ihnvg蛋白重组腺病毒。

gfp监测显示,重组腺病毒转染成功。重组腺病毒能在hek-293细胞中表达

出约58ku产物,与预期的分子质量相符,其tcid50达到1.0×1010.4ml-1。

结果表明,成功构建带有传染性造血器官坏死症(ihn)g基因重组腺病毒载

体,重组腺病毒具有稳定较高的滴度。3.为完成ihn活载体疫苗,评价ihnv活载

体疫苗的效果。

通过对ihn活载体疫苗的安全性试验,最佳使用剂量的确定试验,效力试验,

免疫持续期和保存期