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分子生物学实验设计实验

分子生物学实验设计实验题目：在大肠杆菌中表达绿色荧光基因

（EGFP）学院：生命科学学院专业：生态学教师：吴传芳姓名/学号：

余光辉/20方成/20

一、实验目的在大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白二、实验流程三、实验

试剂、材料及步骤(一)质粒DNA的提取1.原理碱裂解法是一种应用

最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和

SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒

DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与

染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋

白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分

离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求2.试剂LB培养液:胰蛋白

胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl5g，琼

脂（固体培养基）15g，用1NNaOH调pH7.5。

溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na，25mmol/LTris-HCl(pH8.0)

溶液Ⅱ：0.4mol/LNaOH，2%SDS临用前1：1配制。

溶液Ⅲ：5mol/L醋酸钾60ml冰醋酸11.5ml双蒸水28.5ml卡那霉素

(20mg/mL)抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1）无水乙醇70%

乙醇TE缓冲液或ddH2O培养含有pET28a质粒和pEGFP-N3质粒的大

肠杆菌收集裂解细菌、分离纯化质粒DNApET-28a-EGFP的表达及观察

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重组DNA的转化及重组子的鉴定质粒DNA的限制性内切酶酶切及重组

DNA琼脂糖凝胶电泳检测

3.材料含质粒pET-28a和pEGFP-N3菌液1.5ml塑料离心管EP管架微

量取液器和取液器吸头常用玻璃器皿4.实验步骤（1）将带有质粒

pET-28a和pEGFP-N3的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉

素50g/mL），37℃培养过夜（2）取培养菌液1.5mL置Eppendorf小

管中，10000rpm2min，弃上清液（3）加入100L溶液I，漩涡器上充

分混匀，在室温下放置10min（4）加入200L新配制的溶液Ⅱ，轻轻

翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5min（5）加入150L冰冷的溶液

Ⅲ，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15min

（6）10000rpm5min，取上清液于另一干净的离心管中（7）向上清液

中加入等体积（约400L）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v），振荡混

匀，10000rpm10min，将上清液转移至新的离心管中（8）加入等体积

（约370L）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min,取上清液于新离

心管中（9）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置1h

（10）12000rpm5min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干

液体（11）加0.8mL70%乙醇，离心1min，倒去上清液，真空抽干或

室温自然干燥30min（12）加30LddH2O，-200C保存备用5.注意（1）

饱和酚（取下层）单独吸200L，氯仿：异戊醇（24：1）吸200L（2）

制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡（特别是加入溶

液II和III），以避免机械剪切力对DNA的断裂作用(二)DNA琼脂糖

凝胶电泳检测1.原理在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的

2

质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA、闭环超螺旋DNA。

当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线

状〉开环。

但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子

强度及核酸染料含量有关。

2.试剂Goldview（DNA染料）0.5TBE缓冲液上样缓冲液（6）3.材料

提取的pEGFP-N3和pET-28a，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，

封口膜，

剪刀，取液器吸头4.步骤（1）琼脂糖凝胶板的制备：称取0.3g琼

脂糖，置于锥形瓶中，加入30mL0.5T