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地西他滨诱导宫颈癌细胞凋亡分子机制研究

宫颈癌是我国最常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均

较高。我国宫颈癌的发病率近年来呈年轻化的趋势，严重威胁着女性

健康［１］。ＤＮＡ甲基化是表观遗传学改变的主要分子机制之一，

目前正受到科学家们的高度重视和关注［２－３］。腺瘤性结肠息肉

病基因甲基化水平上调导致的基因功能下调是宫颈腺癌发生的早期

事件，具有早期诊断的敏感性和特异性，在肿瘤发生、发展的全过程

中稳定存在［４］，通过抑制ＤＮＡ甲基转移酶活性，能够阻断异常

ＡＰＣ基因的异常甲基化，导致ＡＰＣ蛋白活性恢复。地西他滨（ｄ

ｅｃｉｔａｂｉｎｅ，ＤＡＣ）是目前临床上常用抗癌药物，也是常

见的ＤＮＡ甲基化转移酶抑制剂之一［５］。临床上，ＤＡＣ对急性

髓性白血病和慢性髓性白血病等均有明显疗效。ＤＡＣ用于宫颈癌的

治疗目前鲜见报道，本研究从分子水平探讨ＤＡＣ对宫颈癌的作用机

制，为今后临床应用治疗宫颈腺癌提供新的思路和实验室依据，也可

为宫颈腺癌的分子靶向治疗提供理论依据。

１材料与方法

１．１主要试剂

ＤＡＣ购自美国Ｓｉｇｍａ公司，细胞凋亡检测试剂盒购自北京四正

柏生物公司，鼠抗人ＡＰＣ单克隆抗体购自美国ＲＤ公司，ＰＣＲ试

剂盒购自上海生工公司。

１．２细胞培养宫颈腺癌

Ｈｅｌａ细胞，用含１０％ＦＢＳ的１６４０培养基培养，置于温度

３７℃、５％ＣＯ２、相对湿度为９０％的恒温培养箱中，进行培养。

１．３ＭＴＴ检测

用０．２５％的胰酶消化并收集生长状态良好的宫颈腺癌Ｈｅｌａ细

胞（保证细胞处于单细胞悬浮状态），将细胞调整到约１０４个／孔

的密度铺种于９６孔板，每孔体积约２００μＬ，３７℃、５％ＣＯ２

培养箱内培养过夜；待细胞密度生长至８０％以上时（一般培养过夜

后），加处理因素。设空白对照组和ＤＡＣ处理组，处理组药物浓度

设为０．１、１、１０和２０μｍｏｌ／Ｌ４个浓度，每组设４个复

孔。在培养２４、３６、４８ｈ时加入ＭＴＴ液２０μＬ／孔，继续

培养４ｈ后，将上清液轻轻吸净，再加入ＤＭＳＯ２００μＬ／孔，

予振荡摇匀１０ｍｉｎ，待结晶溶解后。酶标仪设定检测Ａ为５７０

ｎｍ，测出各孔的吸光度，计算抑制率，并绘制出不同细胞系的生长

曲线。

１．４流式细胞术检测细胞周期及凋亡

将人宫颈腺癌Ｈｅｌａ细胞调整为２×１０５ｍＬ－１，接种在６孔

无菌培养板中，每个孔共４ｍＬ，Ｈｅｌａ细胞ＤＡＣ的最终浓度为

１０μｍｏｌ／Ｌ，每组均设复孔３个，设不加药对照孔。置于３７℃、

５％ＣＯ２饱和湿度条件的培养箱内，培养３６ｈ后，收集细胞以进

行染色，流式细胞仪测定。

１．５ＭＳＰ检测ＡＰＣ基因甲基化状况

首先按试剂说明书提取ＤＮＡ，置于－２０℃保存。紫外分光光度计

检测ＤＮＡ浓度。ＤＮＡ浓度计算为Ａ２６０×２００×５０μｇ／ｍ

Ｌ。鉴定ＤＮＡ纯度可通过计算Ａ２６０／Ａ２８０比值。ＭＳＰ检

测主要步骤如下：（１）ＤＮＡ亚硫酸盐修饰：充分振荡进行混匀后，

室温下孵育约５～１０ｍｉｎ。

（２）重悬ＤＮＡ：４℃，１０００ｒ／ｍｉｎ，离心１ｍｉｎ（ｒ

＝１５ｃｍ），弃上清，离心管底部可见一小块白色沉淀物即为ＤＮ

Ａ，加１ｍＬ的７０％乙醇之后振荡，４℃，５００ｒ／ｍｉｎ，离

心１ｍｉｎ（ｒ＝１５ｃｍ），弃上清。每个样本中均加入３０μＬ的

ＴＥ缓冲液溶解，快速强力振荡，直到沉淀完全重悬，置于５０～６

０℃水浴１５ｍｉｎ，以使ＤＮＡ完全溶解，高速离心２～３ｍｉｎ

后，用吸管吸取上清液到一个新的微量离心管中，继续进行ＭＳＰ检

测或储存于－２０℃（可保存≥２个月）或－８０℃（可保存６个月以

上）备用。

（３）设计ＡＰＣ甲基化和非甲基化引物，一组是甲基化引物（Ｍ），

一组是非甲基化引物（Ｕ），引物序列ＡＰＣ－Ｍ上游引物为５′－Ｇ

ＧＴＡＴＡＴＴ－ＴＴＣＧＡＧＧＧＧＴＡＣＧ－３′，下游引物为

５′－ＴＴＣＣＣＧＡ－ＣＣＣＧＣＡＣＴＣＣＧＣ－３′，退火温度

５６℃，扩增片段为９０ｂｐ；ＡＰＣ－Ｕ上游引物为５′－ＴＧＴＧ

ＡＧＧＧＴＡＴＡＴ－ＴＴＴＴＧＡＧＧＧＧＴＡＴ－３′，下游引

物为５′－ＣＴＴＣＴＣＴ－ＣＴＣＣＡＣＴＴＣＣＣＡＡＣＣＣＡ

－３′，退火温度５６℃，扩增片段为１０９ｂｐ。

（４）ＭＳＰ反应：ＰＣＲ反应液：在冰浴条件下配制反应体系２５

μＬ，将下列各成分加入到０．２ｍＬ的无菌ＥＰ管中：１０×Ｔａｑ

Ｂｕｆｆｅｒ２．５μＬ，ＴａｑＨｏｔｓｔａｒｔ０．１５μＬ，ｄ

ＮＴＰ２．０μＬ，上引物１μＬ，下引物１μＬ