Western-Blotting实验报告 _原创精品文档.pdfVIP

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WesternBlotting

本次试验的目的是使同学们掌握WesternBlotting法鉴定目标蛋白的原理和

熟悉WesternBlotting的方法，并了解抗原抗体结合反应的影响因素。

WesternBlotting的blotting译为印迹法，是指将样品转移到固相载体

上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建

立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测

特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对

RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对

单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白

质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。

Western既可以定性，又可以半定量，是初步鉴定蛋白质最方便也是最通

用的方法。它通常分为两种方法：

WesternBlotting方法一:直接法方法二:间接法

优点：1.快速（一种抗体）1.免特异性不受标记影

2.没有二抗交叉反应引起响

的非特异性条带2.信号放大灵敏度高（多

个二抗结合位点）

3.多种标记的二抗可供

选择

4.可选择不同的Marker

缺点：1.免疫反应性降低1.交叉反应引起的非特

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2.无信号二级放大异性条带

3.抗体标记费时昂贵,使2.额外的二抗孵育以及

用不方便条件优化

同时Western又具有多种识别蛋白质的显色方法，主要有以下几种：i.放

射自显影ii.底物化学发光ECLiii.底物荧光ECFiv.底物DAB呈色现常

用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。

一、实验原理

WesternBlotting（蛋白质免疫印迹法）是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳奋力

的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价

键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相

载体上的蛋白质为抗原，与之对应的第一抗体发生免疫结合反应，一抗再与酶或

同位素标记的第二抗体发生免疫结合反应，经过底物显色活放射自显影以检查电

泳分离的提议目的蛋白成分。蛋白质印迹技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免

疫测定特异性高、敏感等诸多优点，能从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定

量检测。

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)、N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)和催

化剂(AP)、加速剂(TEMED聚合成的三维网孔结构(凝胶）。据有无浓缩效应可将

电泳分为两类：

i.连续系统：缓冲液pH值、凝胶浓度