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VZV糖蛋白E基因胞外域的克隆、表达及其应用的研究

目的:分别用原核和真核细胞稳定表达水痘-带状疱疹病毒

(Varicella-zostervirus,VZV)糖蛋白E(glycoproteinE,gE)的基因胞外域,

对融合蛋白进行特异性鉴定和免疫反应性分析,将这两种融合蛋白分别免疫新西

兰家兔,制备兔抗VZVgE多克隆抗体;应用融合蛋白作为抗原建立检测VZV特异

性抗体的血清学试验,开展对VZV感染的流行病学调查,以评价VZV疫苗的免疫效

果,为易感人群VZV感染的诊断和治疗以及水痘预防措施的制定提供重要的实验

依据,并为研制安全性更高的VZVgE亚单位疫苗奠定基础。方法:从临床采集带

状疱疹患者的皮肤囊泡液接种至单层人胚胎成纤维细胞(humanembryo

fibroblast,HF),进行病毒分离;对分离的病毒株进行特征性细胞病变效应

(Cytopathiceffect,CPE),间接免疫荧光和DNA测序鉴定。

将确认的VZV临床分离株体外培养,PCR扩增VZVgE基因胞外域片段,分别

构建原核表达质粒gE-pET-32a(+)和真核表达质粒gE-pCDNA3.1/myc-His(-),

测序后将原核质粒转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞,以异丙基硫代β-D-半

乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导,获得VZVgE原核

表达的融合蛋白。通过SDS电泳、Westernblot鉴定融合蛋白的特异性,

利用Ni2+-NTA柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。

将真核质粒用脂质体介导转染至COS-7细胞,经G418筛选出稳定表达VZVg

E蛋白的细胞株,表达产物经Ni2+-NTA柱纯化;通过RT-PCR检测VZVgE基因的

mRNA,Westernblot和间接免疫荧光检测gE融合蛋白的免疫反应性。分别用

纯化后的原核表达gE蛋白和真核表达gE蛋白免疫新西兰家兔,获得兔抗VZVg

E多克隆抗体。

ELISA法分别测定该抗体及其效价。应用真核细胞表达的gE重组抗原包被

ELISA酶标板,建立VZV抗体检测的血清学试验。

对127份0~10岁正常儿童血清中VZVIgG抗体水平进行检测,以评价VZV

疫苗的免疫效果。结果:利用原核表达,成功诱导表达出VZVgE融合蛋

白,SDS鉴定表明其为包涵体表达,表达量约为3.01mg/ml,Ni2+-NTA柱纯

化后,gE蛋白纯度约为90%。

Westernblot显示,经变性、复性后的该融合蛋白具有良好的免疫反应性。

免疫新西兰家兔后获得兔抗VZVgE多克隆抗体,ELISA测定显示,多克隆抗体效

价为1:6400~1:12800;利用真核表达,成功筛选出能够稳定表达VZVgE基因胞

外域的COS-7细胞株,RT-PCR检测到相应的mRNA,间接免疫荧光和Westernblot

鉴定,该gE融合蛋白具有较强的免疫反应性;COS-7细胞株和其培养液中均有gE

融合蛋白,表达量约为0.632mg/ml,Ni2+-NTA柱纯化后,gE蛋白纯度约为90%。

免疫新西兰家兔后获得兔抗VZVgE多克隆抗体,ELISA测定显示,多克隆抗

体效价为1:25600~1:51200。应用真核gE抗原包被ELISA板,检测了127份0~10

岁儿童血清中VZVIgG抗体,总阳性率为81.89%,特异度和灵敏度分别为93.75%

和88.24%。

结论:本实验成功构建了稳定高效表达VZVgE蛋白的原核表达和真核表达

系统,获得较高纯度的gE蛋白,有利于全面研究此蛋白的生物学功能,并为VZV

亚单位疫苗的制备奠定基础。制备了特异性及效价较高的兔抗VZVgE多克隆抗

体,建立了快速诊断VZV感染的ELISA血清学试验,有助于VZV疫苗免疫效果的监

测和VZV感染的流行病学调查,为水痘预防措施的制定提供了重要的实验依据。