人CD1d分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备.pdf

人CD1d分子胞外区的原核表达及其多克隆

抗体的制备

作者：陈章权*,黄震,梁晓东,陆田田,何天文

【摘要】目的:原核细胞表达人CD1d分子胞外区及制备其

多克隆抗体。方法:用RT-PCR法扩增人CD1d分子胞外区基因,将其

克隆入原核表达载体pET28中,转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG

诱导重组蛋白的表达,用亲和层析法纯化重组蛋白,以之为免疫原免

疫小鼠制备多克隆抗体,并以ELISA、Westernblot及免疫组织化学

法检测抗体。结果:在原核细胞中高效表达和纯化了人CD1d分子胞外

区蛋白,用其免疫小鼠,获得了效价高、特异性较好的多克隆抗体,

免疫组织化学检测显示该抗体可识别人小肠组织中的天然CD1d分子。

结论:成功制备了人CD1d分子胞外区重组蛋白及鼠抗人CD1d分子胞

外区抗体,为进一步建立人CD1d分子的免疫学检测方法及其生物学

功能的深入研究奠定了基础。

【关键词】CD1d基因表达抗体制备

CD1分子是独立于MHC分子之外的第三类抗原提呈分子,分

为CD1-I和CD1-II两组,前者包括CD1a、CD1b、CD1c和CD1e等4

个分子,后者只有CD1d分子［1］。CD1d分子由胞内区、跨膜区和胞

外区组成,胞外区又由α1、α2和α3等3个结构域组成,它主要提

呈糖脂抗原,在免疫调节及与感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤

等疾病的发生发展过程中起重要作用［1,2］。在CD1d基因克隆过程

中,我们发现在某些疾病患者体内存在

α3结构域或跨膜区缺失的变异体,跨膜区缺失的变异体的存在

提示患者体内可能存在可溶性CD1d分子。为此,我们拟建立双抗体夹

心ELISA法进行可溶性CD1d分子的检测,但目前尚未见有其商品化

ELISA检测试剂盒。特异性抗体的获取是建立ELISA检测方法的关键

所在,在成功制备兔抗人CD1d分子α3结构域抗体［3］的基础上,我

们又对人CD1d分子胞外区编码基因进行了重组表达,并制备了其鼠

源性抗体。

1材料和方法

1.1材料大肠杆菌DH5α、大肠杆菌DL21-DE3为本室保存。

克隆载体pGEM-T、反转录试剂盒购自Promega公司;表达载体pET28

和Ni2+-NTA凝胶为Invitrogen公司产品。RNA提取试剂、PCR产物

回收、质粒纯化试剂盒为QiaGen公司产品。Taq酶购自大连宝生物

工程公司。IPTG及DAB购自上海生物工程有限公司。HRP标记的羊抗

鼠IgG为Chemicon公司产品。PVDF膜为美国PALL公司产品,常规试

剂为国产分析纯。引物合成及DNA序列测定委托上海生物工程公司完

成。BALB/c小鼠由广东医学院实验动物中心提供。

1.2方法

1.2.1CD1d分子胞外区编码基因的克隆取手术切除的新鲜

人小肠组织抽提RNA,经鉴定RNA无降解后进行反转录,操作按反转

录试剂盒说明进行。以合成的cDNA为模板进行hCD1d胞外区编码基

因扩增,引物如下:1:5′-CCATGGTCCCGCAAAGGCTTTTCCC-3′(划线部

分为NcoI酶切位点),引物2:5′

-CTCGAGCCAGTAGAGGACGATGTCCTG-3′(划线部分为XhoI酶切位点)。

PCR条件为94℃变性30s,55℃退火50s,72℃延伸40s,32个循

环后,于72℃延伸7min。PCR产物经10g/L的琼脂糖凝胶电泳分析

回收纯化。将纯化的PCR产物与pGEM-T载体连接后,转化感受态大肠

杆菌DH5α。转化菌液涂布于含氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB平

板,于37℃培养过夜,挑取白色菌落进行培养,提取重组质粒,以