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PCR技术应用一：诊断单基因疾病

自1987年秋以来，PCR技术的应用开创性地推动了产前单基因缺陷者及携带者的诊断。

目前PCR还不能用于诊断所有已知缺陷疾病，但极大地扩大了实验诊断学家对诊断方法的

选择。JohnHopkins大学的研究人员表明，在诊断基因缺陷疾病方面PCR技术具有快速、

准确、操作灵活等特点。每项进展的实例在以后描述。在1987年10月前，我们用Southern

印迹法产前诊断镰刀红细胞贫血症通常需要两周或更长时间，而1987年10月以后，应用

PCR只需2-4天。在1987年以前，几乎所有的β－地中海贫血症的产前诊断都是通过检测

在β－珠蛋白簇中连锁DNA的多态间接完成的，一般需要2-4周。1987年10月以后，用

PCR扩增β－珠蛋白基因区后，直接检测致病突变即可完成β－地中海贫血症的产前诊断。

这个方法既增加了准确性，又缩短了时间，一般只需一周时间。该项改进技术的作用，（1）

如果我们不能确定在父母双方中β－地中海贫血的突变位置，我们还可以在1、2天之内研

究β－珠蛋白基因簇中DNA的多态性；（2）通过比较母亲与胎儿DNA序列差别来判断

母亲传染的程度。这只是说明PCR对基因诊断意味着什么的几个例子。以下我们举几个特

例具体说明PCR技术的应用：（1）通过扩增产物的打点杂交或限制性内切酶酶解方法确

定已知的点突变；（2）通过对扩增产物直接测序来发现已知或未知的突变；（3）通过改

变PCR扩增产物的大小或产物不能特异扩增来发现异常缺失；（4）通过对DNA多态性

研究来间接诊断致病突变。最后，还将讨论PCR技术的技术性难点、重要控制条件及局限

性。

产前基因诊断基础知识

产前基因诊断是逐步发展起来的，而且在不断完善。1978年Kan和Dozy提出应用与

β－蛋白基因连锁的DNA多态性来间接诊断镰状红细胞贫血。此种诊断需要进行家族性研

究，以确定父母双方的多态性等位基因类型，此等位基因型是用正常β－珠蛋白基因及镰

状红胞β－珠蛋白基因探知的。家族被调查成员包括夫妇俩的孩子，如没有孩子，则调查

夫妇双方的父母。到1982年，通过利用MstⅡ限制性内切酶方法可以直接产前诊断是否有

镰状红细胞贫血，因为内切酶MstⅡ及其同功酶Cv嗷蛳xnNⅠ不能在突变位点降解镰状β

－珠蛋白基因而可在此位点降解正常βA－珠蛋白基因。这种改进不需家族调查，就可更准

确地进行镰状贫血病的产前诊断。正是这种改进法，使直接而简便地确定致病突变成为可能，

这也是我们在所有基因诊断研究中所力求的。

单基因缺陷的诊断是通过对连锁DNA多态性研究及家族研究而确定的。到1988年底，

我们利用这种方法诊断了一些患Duchenne肌营养不良症病人、大多数甲型和乙型血友病

人、所有囊性纤维变性病人及Huntington氏病、神经性纤维瘤和成人多囊肾病人。应用这

种技术同时直接发现了镰状红细胞贫血、β－地中海贫血、α地中海贫血有大多数Duchenne

肌营不良症、部分甲型血友病和成视网膜细胞瘤病人的致病突变。几乎所有这些病例中，由

于重要的DNA序列是已知的，所以PCR技术在产前诊断、症发前诊断及携带者发现等方

面具有非常重要的价值。

应用PCR技术直接发现点突变

在点突变诊断中，继PCR技术之后可用三种技术一打点杂交、酶切分析及直接测序。

JohnHopkins大学研究人员应用以下几步来诊断镰状红细胞贫血：（1）将人绒毛膜样品

（CVS）或羊水中得到的胚细胞在2MNaCl，0.1NNaOH溶液中煮沸。（2）应用PCR技术

在β珠蛋白基因5末端扩增一个725bp区，用30个循环，72℃链延伸120。（3）用CvnI

酶消化725bp扩增产物。（4）降解的产物进行电泳。（5）EB染色。（6）紫外灯下观察

DNA片段，并拍照。

在反应中选择使扩增产物含有两固定CvnI位点的引物。因此，酶解产物至少应可见三

条带。每个镰状红细胞的β珠蛋白基因含有一个381bp带，而正常βA珠蛋白基因经酶结

果已积累了大量信息，所以我们倾向选用限制性内切酶法消化经PCR扩增的产物，而不是

利用特异寡核苷酸探针经打点杂交来诊断βS突变位置的β突变位置。然而，这种方法的的

局限性（也是Souther