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荧光分光光度计的使用

实验目的：

掌握荧光分光光度计的基本使用方法、扫描激发光谱、发射光谱、荧光强度

等。

掌握荧光定量分析方法。

实验原理：

荧光分光光度计是常用的光学仪器，在定量分析样品的光谱性质表片时经常

用到。

荧光分光光度计的基本功能是完成激发光谱，发射光谱的扫描，进行相对荧

光强度的测理。从激发光濂可以获得样品激发态能级的分布情况，用来选择定量分

析的最佳激发波长。从发射光谱可以知道样品基态能级的分布情况。用来选择定量

分析的最佳发射波长。荧光定量分析法的方法与紫外可见吸收光谱类似。但需要注

意荧光强度值是相对值。同一样品，同一仪器在不同仪器参数时获得的荧光强度是

不同的。只有当测量仪器参数完全相同时，不同的样品荧光强度的相互比较才有意

义。

与紫外可见吸收光谱类似，分子荧光光谱也是分子光谱，其谱峰较宽，片片

性不是很强。谱峰重叠现象比较普遍。为了减小谱峰宽度。避免谱峰重叠，提高分

析的选择性，在定量分析时常采用同步荧光的方法进行。同步荧光是同时扫描荧

光分光光度计的激发和发射单色仪得到的谱图。通过选择合适的扫描参数。可以使

样品谱峰变窄，并避免不同组份的谱峰重叠，得到比较好的分析效果。

同步荧光扫描有固定波长同步荧光法，固定能量同步荧光法，可变角同步荧

光法等。

扫描已知样品荧光激发和发射光谱时，可先根据参考波长来进行。扫描末知

样品的荧光光谱，可以将发身波长先每隔一定波长（例如50nm）扫描一个激发光

谱，对比不同位置的激发光谱，从最强的激发光谱中选择最大激发波长，设定该波

长为激发波长，扫描发射光谱。再从新得到的发射光谱中找到最大发射波长，在最

大的发射波长处重新扫描激发光谱。

扫描样品激发光谱和发射光谱时，需要注意：扫描激发光谱时，激发单色器

扫描范围的长波端一般应小于发射波长；扫描发射光谱时，发射单色器扫描范围的

短波端应大于激发波长。否则在发射光谱（激发光谱）中与激发波长（发射波长）

波长相同的位置会出现很强的散射谱峰。这不是样品的荧光引起的，应当注意区

分。

如果样品不是真正的溶液，或包含有不溶性颗粒物，或是固样性品，如果扫

描范围较宽时，通常在发射光谱（激发光谱）中波发波长（发射波长）速数倍波长

的位置也会出现较弱的散射谱峰，称为倍频峰。在分析光谱情况时也应当注意区

分。对散射倍频峰或样品荧光峰，可通过适当改变激发波长来进行区分。散射倍频

峰的位置也会随着激发峰的位置变化而变化。而荧光峰的位置通常是不变的。如果

倍频峰对样品的测是有干扰，可使用合适的滤光片消除倍频峰。合适的消倍频峰滤

光片应可以使发射光透过，阻挡激发光透过。

如果样品荧光较弱，使用高灵敏度档测定时，通常会观察到溶济的拉曼峰。

也应当注意与样品荧光进行区分。拉曼峰的位置也与激发波长有关，同时也随着激

发波长的变化而变化，其位置可以估算出来。

实验材料：

FITC-OVA蛋白质溶液

FITC最大吸收光谱为：490-495nm

最大发射光谱为：520-530nm

呈黄绿色荧光

实验内容：

1、FITC-OVA蛋白质，进行不同浓度、不同激发波长、固定发射波长下的数

值变化。

发激波长发射波长

480nm525nm

485nm525nm

490nm525nm

495nm525nm

500nm525nm

505nm525nm

510nm525nm

将FITC-OVA样品超纯水稀释成不同浓度，吸100ul置于96孔板中，读荧光光度计

值。

2、FITC-OVA蛋白质，进行不同浓度、相同激发波长、不同发射波长下的数

值变化。

激发波长