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引物套装（染料法）操作说明
一、试剂组成及配制
试剂
纯化方式
净含量
溶液配制
RTPrimer（特异性逆转录引物）
PAGE
粉剂1nmol×1支
在管中加入100μLRNase-freeH2O配制成10μM储存液
PCRPrimerset（PCR引物对）
PAGE
粉剂2nmol×1支
在管中加入200μLRNase-freeH2O配制成10μM储存液
RNase-freeH2O（去RNA酶水）
液体1.5mL×1支
备注：
干粉剂溶解前，10000r/min，离心15～30s，将干粉离心于管底。引物溶液4℃短期储存，长期保存置于-20℃,可保存6个月。
二、操作步骤
1.基因特异性逆转录反应体系的制备
A在无RNase的离心管中混合下列试剂进行预变性
试剂
终浓度
加量/孔
RTprimer(1μM)
60nM
1.2μL
RNASample
1μg
2μL
B加热70℃,5min后，马上置于冰盒上*
C按照下表提供的20μL逆转录反应体系混合其他试剂
试剂
终浓度
加量/孔
5×MMLVRTBuffer
1×
4μL
dNTP（10mM）
0.375mM
0.75μL
RNasin（40U/μL）（可选*）
0.5U/μL
0.25μL
MMLVReverseTranscriptase（200U/μL）
40U
0.2μL
RNase-freeH2O
To20μL
D运行mRNA逆转录程序：42℃45min，85℃5min，4℃保存
运行miRNA逆转录程序：26℃40min，42℃40min，85℃10min，4℃保存注*：根据用户具体需求，步骤B可选择省略；RNasin为非必需试剂，请客户自备。
2.染料法定量PCR20μL反应加样量体系[1,2]
试剂
终浓度
加量/孔
2×Real-timePCRMasterMix（SYBR）
1×
10μL
PCRPrimerset（10μM）
0.2μM
0.4μL
ROXreferencedye（50×)（依据机器型号选择*）
1×or5×
0.4μLor2μL
TaqDNApolymerase（5U/μL）
1U
0.2μL
RTproduct
2μL
RNase-freeH2O
To20μL
2
3.实时定量PCR反应程序A：一步法扩增（推荐）
95℃3min，1×循环；95℃12s，62℃40s，40×循环，采集荧光信号B：两步法扩增（可选*）
95℃3min，1×循环；95℃12s，62℃30s，72℃30s，40×循环，采集荧光信号注*：用户可根据具体需求选择扩增反应程序，操作步骤参考本公司荧光定量检测试剂盒。
三、数据计算
1.进行荧光定量PCR反应得到每个反应的目标基因和内参基因的Ct值。
2.计算样品和校正样品三复孔的平均值。
3.目标基因的平均Ct值减去内参基因的平均Ct值，计算各个样品的ΔCt值。
ΔCt（试验样品）=Ct（试验样品目的基因）–Ct（试验样品内参基因）ΔCt（校正样品）=Ct（校正样品目的基因）–Ct（校正样品内参基因）
4.试验样品的ΔCt值减去校正样品的ΔCT值，计算得到各个样品的ΔΔCT值。
ΔΔCt（样品）=ΔCt（试验样品）?ΔCt（校正样品）
5.利用2–ΔΔCt计算相对基因表达比率，参考文献[3,4]
四、注意事项（使用前请详细阅读）
1.本说明书操作步骤及反应体系均在本公司实验条件下研发，如使用其他公司产品，请以其说明书为准。
2.由于本公司设计的miRNA是特异性茎环结构引物，如果使用miRNA引物套装时，逆转录一定要使用设计对应的特异逆转录引物（RTPrimer），若使用其他逆转录引物，引物效果将无法保障。miRNA引物套装不适用通用逆转录引物如randomprimer、oligodT等产物扩增检测。
3.本说明书中PCRPrimerset终浓度0.2μM为推荐浓度，可在0.1-0.5μM范围内调整。
4.建议退火温度（62℃)及反应程序，可根据仪器设备、反应试剂等实际情况适当优化。
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