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结肠癌肿瘤浸润性B淋巴细胞免疫球蛋白基因序列特点的研究

目的:结肠癌是常见消化道肿瘤之一,严重威胁着人们身体健康。2019年美

国癌症协会新发布的癌症数据显示,预计2019年美国约有101420名结肠癌新增

病例,51020名结肠癌所致的死亡病例,结肠癌在男性和女性中均为癌症相关死

亡的第三大原因。

这与必威体育精装版的真实统计数据所显示的2016年结直肠癌死亡率位居癌症死亡原

因第三位相一致。结肠癌是一种高度可治疗的疾病,当局限于肠道时往往是可以

治愈的。

手术仍然是主要的治疗方式,并可治愈约50%的患者。术后复发是其重要问

题,往往是患者的最终死亡原因。

依照微卫星不稳定状态,结肠癌可简单分为两种分子亚型:微卫星高度不稳

定型(highlevelmicrosatelliteinstability,MSI-H)和微卫星稳定型

(microsatellitestability,MSS)。MSI-H表型存在于15%的早期结直肠癌中,

预后良好。

MSI-H结肠癌具有明显的组织学特征,而且肿瘤浸润淋巴细胞(tumor

infiltratinglymphocytes,TILs)数量增加。已有研究表明作为TILs中的重要

成分之一,肿瘤浸润性B淋巴细胞(tumorinfiltratingBlymphocytes,TIL-B)

密集浸润与改善结肠癌患者预后有关,这与之前乳腺癌、卵巢癌等其他癌症的研

究结果一致,但TIL-B在结肠癌的产生与发展中发挥的具体免疫作用机制尚不清

楚。

本研究旨在探究结肠癌TIL-B免疫球蛋白的基因序列特点。进一步分析

MSI-H与MSS结肠癌患者基因序列的差异,为结肠癌的免疫治疗新靶点的研究提

供可行的理论基础。

材料与方法:收集山东大学齐鲁医院2017年11月30日至2018年1月3日

行结肠癌根治性切除手术患者的新鲜肿瘤组织,加入去核糖核酸酶

(ribonuclease,RNase)保存液中,储存于-80℃冰箱中备用。后经病理结果及免疫

组化证实后,从中选取MSI-H、MSS各4名患者,尽可能匹配两组患者年龄、性别、

病理类型及TNM分期。

快速研磨肿瘤组织,提取核糖核酸(ribonucleicacid,RNA),并反转录为互

补脱氧核糖核酸(complementarydeoxyribonucleicacid,cDNA)。使用提前设计

的免疫球蛋白重链特定序列引物通过巢式聚合酶链式反应(nestpolymerase

chainreaction,NestPCR)扩增重链基因,琼脂糖凝胶电泳检测DNA条带,并回收

扩增后DNA产物,将其连接入载体,转化至DH-5α感受态大肠杆菌内进行扩增,氨

苄青霉素筛选单克隆菌落,每例患者挑取50-100个菌落,分别进行LB肉汤培养繁

殖大肠杆菌,从中提取DNA进行测序。

同时收集2名正常成年人外周血,分离单个核细胞,提取RNA后进行如上操作,

作为对照。VDJ基因使用频率、互补决定区3(complementaritydetermining

region3,CDR3)编码氨基酸的长度、氨基酸所带正负电荷数目及极性、体细胞突

变频率等应用IMGT等生信软件进行分析。

应用GraphPadPrism8统计作图软件制作图表。结果:1.MSI-H1患者表现

为MLH1和PMS2表达缺失,MSI-H2、MSI-H3患者均表现为MSH2及MSH6两种错配

修复蛋白的表达缺失,MSI-H4患者仅为MSH6表达缺失。

MSI-H2、MSI-H4接受术后辅助化疗。MSI-H4患者于术后5个月复查见多发

转移,术后9个月去世。

MSS-2于术后5个月复查怀疑转移肺腺癌,给予化疗后病情稳定,现定期复查

中。其余患者复查均未查见复发或转移。

2.正常人外周血B细胞的有效基因序列所占百分比平均值约为86.99%,即送

检样本中约86.99%的外周血B细胞免疫球蛋白重链编码基因的互补决定区

(complementaritydeterminingregion,CDR)V、D、J段序列查见重排,MSI-H

组有效基因序列百分比平均值约为90.62%,与正常人数值接近;MSS组仅为

75.93%,比对照组数值明显减低。提示MSI-H患者TIL-B可能为抗原刺激下诱导

突变,而MSS