组氨酸标签融合蛋白的亲和纯化实验报告 .pdfVIP

组氨酸标签融合蛋白的亲和纯化实验报告

实验目的

1、了解外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达情况

2、学会用SDS-电泳法分离不同分子量的蛋白质

3、学习通过亲和层析法纯化目的蛋白

4、学会考马斯亮蓝染色法和蛋白质杂交法检测蛋白质

实验原理

1、外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达：将外源基因克隆在特殊

的表达载体中，让其在E。coli中表达，该表达载体上含有lac操作子

的启动子。在不加诱导剂的条件下培养宿主菌，lacI基因表达的阻遏蛋

白LacI与lac操作子结合，使外源基因不能表达；向培养基中加入诱导

物IPTG后，LacI阻遏蛋白变构失活，不能与lac操作子结合，外源基因

就表达。

2、蛋白质SDS-电泳分离：SDS-是最常用的定性分析蛋白质的电泳方

式，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。其分离原理是根据

蛋白质分子量的差异，因为SDS-的样品处理液及缓冲液的加入破坏了蛋

白质的二级、三级、四级等结构，并使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-

蛋白质复合物，稳定地存在于均一的溶液中，SDS与蛋白质结合后使SDS-

蛋白质复合物上带有大量的负电荷，远远超过其原来所带的电荷，从而使

蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计，消除了不同分子之间原有的电荷差

别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小，这样分离出的谱带也

为蛋白质的亚基。

3、考马斯亮蓝法检测蛋白质：考马斯亮蓝是一种蛋白质染料，主要

有R-250和G-250两种类型。考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残

基或芳香族氨基酸残基（Arg，Trp，Tyr，Hi，Phe）结合。考马斯亮

蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；因为考马斯亮

蓝R250中的R代表Red，偏红，红蓝色，与蛋白质结合虽然比较缓慢，

但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染色后为蓝色，且与胶的结合可以

被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。

4、基因融合就是将两个或多个开放读码框按一定顺序连接在一起，

融合阅读框架的表达产物是一个杂和蛋白。在E。coli的pET表达系统

中表达N端含有Hi-tag（组氨酸六聚体）的融合靶蛋白，然后用亲和层

析的方法进行纯化。

5、蛋白质杂交法：蛋白质杂交也称Weternblotting，首先是要将

电泳后分离的蛋白从凝胶中转移到PVDF膜上，本实验使用电泳印迹湿转

法。这种方法是用有孔的塑料和泡沫将凝胶和NC、PVDF膜夹成“三明治”

形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳

方向就可以使蛋白质在电场力的作用下离开凝胶结合到PVDF膜上。转移

后PVDF膜就称为一个印迹（blot），用于对蛋白质的进一步检测。印迹

首先用蛋白溶液处理以封闭PVDF膜上剩余的疏水结合位点，而后用一抗

处理，待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，清洗除去未

结合的一抗，进一步用适当标记的二抗处理，带有标记的二抗与一抗结合

形成抗体复合物可以指示一抗的位置。

实验仪器与材料、试剂

1、实验仪器：超净工作台、试管、摇床、离心机、垂直板电泳仪、

空气浴摇床、低温离心机、电泳仪、超声破碎仪等。

2、实验材料：大肠杆菌BL21；重组质粒pET-，PVDF膜

3、实验试剂：

（1）50mg、ml卡那霉素。

（2）1MIPTG：

（3）LB液体培养基

(4)蛋白质Marker

(5)

30％Acr、Bi（丙烯酰胺溶液

(6)1、5MTri-HCl（pH8。8）：

(7)0。5MTri-Hcl（PH6。8）：

(8)10%（w、v）SDS（十二烷基磺酸钠）溶液:

(9)10%AP（过硫酸铵溶液,AP

(10)TEMED：商品液。

(11)10电泳缓冲液(12)

（13）1膜转移液(1000ml)：

（15）洗膜缓冲液TBST

（16）封闭液（3%BSA）（100ml）（17）3ml，NaCl

（18）显色液（10ml）：（19）染色液（100ml