紫外吸收法测定蛋白质含量.ppt

关于紫外吸收法测定蛋白质含量一、实验目的学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理；熟练掌握紫外分光光度计测定原理及使用方法。第2页,共15页，5月，星期六，2024年，5月二、实验原理

由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度OD280nm与其浓度呈正比关系，可作定量测定。第3页,共15页，5月，星期六，2024年，5月三、实验材料、主要仪器和试剂

1．试验材料：待测的蛋白质溶液。2．?主要仪器：（1）紫外分光光度计，（2）试管与试管架，（3）刻度吸量管3．试剂：（1）标准牛血清蛋白溶液：准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清蛋白，配制成浓度为1mg/mL的溶液。（2）待测蛋白质溶液：浓度为1mg/mL左右的溶液第4页,共15页，5月，星期六，2024年，5月四、操作步骤1．标准曲线制作按下表分别向每支试管内加入各种试剂，混匀。以光程为1cm的石英比色杯，在280nm波长处测定各管溶液的光密度值OD280nm。以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出标准曲线。第5页,共15页，5月，星期六，2024年，5月2．样品测定取待测蛋白质溶液1mL，加入蒸馏水3mL，混匀，按上述方法测定280nm的光密度，并从标准工作曲线上查出待测蛋白质溶液的浓度。第6页,共15页，5月，星期六，2024年，5月五、附注1．在测定工作中，可以利用280nm及260nm的光密度值求出蛋白质的浓度：蛋白质浓度（mg/mL）=1.45OD280nm―0.74OD260nm上式中的OD280nm是蛋白质溶液在280nm下测得的光密度，OD260nm是蛋白质溶液在260nm下测得的光密度。第7页,共15页，5月，星期六，2024年，5月2．对于有核酸存在时所造成的误差，可将待测的蛋白质溶液稀释至光密度在0.2~2.0之间，选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm及260nm处分别测出光密度OD280nm/OD260nm的比值，从下表中查出校正因子“F”值，同时可查出该样品内混杂的核酸的百分含量，将F值代入下述公式，即可计算出该溶液的蛋白质浓度。蛋白质浓度（mg/mL）=F×OD280nm×D式中：OD280nm为被测溶液在280nm紫外波长下的光密度，D为溶液的稀释倍数。第8页,共15页，5月，星期六，2024年，5月OD280nm/OD260nm校正因子核酸%OD280nm/OD260nm校正因子核酸%1.751.1160.000.8460.6565.501.631.0810.250.8220.6326.001.521.0540.500.8040.6076.501.401.0230.750.7840.5857.001.360.9941.000.7670.5657.51.300.9701.250.7530.5458.001.250.9441.500.7300.5089.001.160.8992.000.7050.47810.001.090.8522.500.6710.42212.001.030.8143.000.6440.37714.000.9790.7763.500.6150.32217.000.9390.7434.000.5950.27820.000.8740.6825.00???注：通常纯蛋白质的OD280nm/OD260nm约为1.8，而纯核酸的比值约为0.5。第9页,共15页，5月，星期六，2024年，5月六、思考题

1．紫外吸收法与Folin-酚比色法测定蛋白质含量相比，有何缺点及优点？2．若样品中含有核酸类杂质，应如何校正？第10页,共15页，5月，星期六，2024年，5月参考答案1．蛋白质测定的Folin-酚比色法（即Lowry法）的定量范围为5～100μg蛋白质，灵敏度高；但操作要费较长时间，且Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用；不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度也稍有不同。紫外吸收法测蛋白质含量迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，已在蛋白质和酶的生化制备中广泛采用，尤其在柱层析分离纯化中，常用280nm进行紫外检测，来判断蛋白质吸附或洗脱情况。第11页,共15页，5月，星期六，2024年，5月但该法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较