目的基因的制备 (3).ppt

2）酵母双杂合系统第96页,共97页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第97页,共97页，星期六，2024年，5月**c)mRNA-cDNA克隆法方法：在mRNA反转录合成cDNA第一链后，将dA残基加到mRNA：cDNA杂交体上，然后与带dT尾的克隆载体连接，转化受体细在宿主细胞内，mRNA被降解并代之以DNA.缺点：克隆的效率低（为双链cDNA克隆的1/10）第64页,共97页，星期六，2024年，5月6)cDNA文库的筛选和鉴定核酸杂交:是最常用、最可靠的方法之一.可大规模地分析文库的克隆子*同源探针：至少含有所需cDNA克隆的一部分确切序列.常用于以一个部分克隆分离cDNA文库中的全长克隆.*部分同源探针：探针的序列与所要筛选的cDNA克隆的序列相关但不相同.常用于克隆家族基因.第65页,共97页，星期六，2024年，5月b)特异性免疫学检测:在cDNA表达文库中，目的基因的表达产物能与特异性抗体发生免疫学反应，通过酶学的方法加以检测.c)cDNA克隆的同胞检测:将cDNA文库分成若干组含有10-100个克隆子的易于处理的cDNA文库，对每组cDNA文库进行检测，当鉴定出阳性库后再不断将其分成更细的库进行检测，直到获得阳性单克隆．第66页,共97页，星期六，2024年，5月第三节目的基因的分离1.目的基因的功能克隆1)根据蛋白质氨基酸序列分离目的基因对于未知功能的蛋白质基因，其目的基因的分离可从蛋白质开始，通过蛋白质的分离纯化、蛋白质氨基酸序列的测定、相对应的基因片断序列的设计，制备PCR扩增引物或合成DNA探针，从总DNA中分离目的基因片断。或根据特异性蛋白质制备特异性抗体，然后从表达文库中筛选克隆子第67页,共97页，星期六，2024年，5月从蛋白质到目的基因的分离第68页,共97页，星期六，2024年，5月2)功能互补克隆目的基因从某一基因组中提取总DNA，经限制性内切酶不完全酶切后，与克隆载体连接，转化某一种与目的基因功能互补的缺陷型受体细胞。当含有目的基因片断的重组质粒进入受体细胞后，细胞才能生长，从而很方便地将含目的基因的克隆子挑选出来。第69页,共97页，星期六，2024年，5月2.序列克隆法分离目的基因1)根据部分已知序列或同源序列分离目的基因如果知道某个基因的一部分序列，或知道某基因的家族基因的序列，则可根据已知序列或家族基因高度保守的同源序列合成DNA探针，通过探针杂交技术，从DNA酶切片断或克隆子中筛选所要克隆的目的基因片断或克隆子。第70页,共97页，星期六，2024年，5月同源探针杂交克隆目的基因第71页,共97页，星期六，2024年，5月2)表达序列标签法分离目的基因利用基因序列中一段特异性的DNA片断（100-500bp)作为该基因与其它基因差异的标签（expressedsequencetag,EST)，然后以该标签作为获得新基因的依据。第72页,共97页，星期六，2024年，5月3)基因表达系列分析法基本原理：一个基因转录的mRNA上一段9-10个碱基的核苷酸序列（sequencetag,ST,序列标签）代表一个特定的转录产物，它们能被识别位点为四个碱基的限制性核酸内切酶（anchoringenzyme,AE,锚定酶）所切割。多个序列标签通过酶切和酶连后成为双标签序列的多联体，将多联体克隆到测序载体上。通过连续序列分析确定每个ST序列在转录产物中的拷贝数（频率）。通过与Genebank序列比较，确定某一种ST序列是新的基因或是已克隆的基因。第73页,共97页，星期六，2024年，5月基因表达系列分析法克隆分析目的基因第74页,共97页，星期六，2024年，5月3.杂交法分离目的基因1)差别杂交法:对于两个不同生长状态的细胞群体，目的基因在其中一个细胞群体中得到表达，而在另一个细胞群体中没有表达，两个细胞群体的mRNA存在明显差异。利用可表达目的基因的mRNA构建cDNA文库，分别与两个细胞群体总mRNA反转录后制备的cDNA探针进行杂交，根据杂交结果的差异，筛选阳性克隆子。第75页,共97页，星期六，2024年，5月差别杂交法筛选含目的基因的阳性克隆子第76页,共97页，星期六，2024年，5月2)减法杂交分离目的基因减法杂交（subtractivehybridization)：又称为扣除杂交或减数杂交。通过杂交技术除去两种细胞群体中普遍存在的基因序列，使目的基因序列得到有效的富集。适合于目的基因拷贝数较低的基因的分