基因工程概论（5分离克隆）.pptx

基因工程概论;5目的基因的分离克隆;A鸟枪法;随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离。;使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率。;例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6-2.0kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进;工作量较大，需要了解目的基因的背景知识;BcDNA法;mRNA;cDNA第二链的合成;双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：;并非所有的mRNA分子都具有polyA结构;CPCR法;聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction，PCR）又称为PCR;使用PCR技术克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目;;由TaqDNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带有一个非模板依赖性的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为TaqDNA聚合酶对dATP具有优先聚合的活性。由于该突出碱基的存在，克隆时便可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的T载体克隆;D化学合成法;化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。

从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的。;;;E基因文库的构建;基因库（genepool）;用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA;基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它;除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：;为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整??，用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大，经切割处理后的样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就;用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制;出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体。由于绝大多数真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒。;大型基因组文库一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除了一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白编码基因等）可以采用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选法、酵母双杂交技术等）直接筛选外，一般的基因组文库筛选均需多轮操作步骤;密集铺板（1-10万）技术：;在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：;5目的基因的克隆