第二章分子克隆的工具酶.pptxVIP

第二章分子克隆的工具酶;任何物种都有

排除异物保护自身得防御机制

免疫系统

细菌得限制与修饰系统;第一节限制性内切酶;一、限制与修饰

Restrictionandmodification;E、coliKE、coliBE、coliC;E、coliKE、coliBE、coliC;说明K和B菌株中存在一种限制系统

可排除外来得DNA

10-4得存活率就是由宿主修饰系统作用得结果

甲基化:AN6甲基-腺膘呤

C5’甲基-胞嘧啶

;2、限制酶得发现

60年代,限制内切酶和限制酶得概念

1968年首次从E、coliK中分离限制性内切酶

;9;1970年美国约翰·霍布金斯大学H、Smith偶然发现

流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)

能迅速降解外源得噬菌体DNA

细胞提取液可降解E、coliDNA

但不能降解自身DNA

即HindII酶;5’、、、GTPyPuAC、、、3’

3’…CAPuPyTG、、、5’;5’、、、GAATTC、、、3’

3’…CTTAAG、、、5’;3、限制酶得命名;例如:HindⅢ

Haemophilusinfluenzae(流感嗜血杆菌),

ｄ:表示菌系为ｄ型血清型;

Ⅲ:表示分离到得第三个限制酶。

EcoRI—EscherichiacoliRI

EcoRI表示基因位于Escherichiacoli中得抗药性R质粒上

HindⅢ—HaemophilusinfluensaedⅢ

SacI(II)—StreptomycesachromogenesI(Ⅱ);第Ⅰ类酶(切割部位无特异性):

如EcoB(大肠杆菌B株)、EcoK(大肠杆菌K株)分子量较大(约300000),作用时需ATP、Mg++等辅助因子;二、限制酶得识别序列

;R=AorGY=CorT

M=AorCK=GorT

S=CorGW=AorT

H=AorCorTB=CorGorT

V=AorCorGD=AorGorT

N=AorCorGorT;EcoRI5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’

;三、限制酶产生得末端种类

1、粘性末端

１)３’-端突起,

２)５’-端突起,个数为２或４个核苷酸;?2、平末端

SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’

3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’

在对称轴上同时切割DNA得两条链

HaeIIIGG↓CC

EcoRVGAT↓ATC

XmnIGAANN↓NNTTC

;3、非对称突出端

①来自非对称识别序列

CCTCAGCBbvCI

GGAGTCG

;②简并序列

AccIGT/MKAC

GTATAC

GTAGAC

GTCTAC

GTCGAC;③间隔序列

DraIIICACNNNGTG

EarICTCTTC(1/4)

GAGAAG

;4、同裂酶

1、定义:能识别相同序列但来源不同得两种或多种限制酶

2、特点:1)识别相同顺序

2)切割位点得异同

KpnIGGTACCAsp718GGTACC

SstICCGCGGSacICCGCGG;①