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蛋白分子成药性评价简述

摘要

近些年来，治疗性抗体及抗体类蛋白已经成为欧美新批准药物的一大组成部分，此类药物的临床试验数量呈迅速增长的趋势。一个可成功开发成商业化药物的治疗性蛋白，不仅应具有理想的药效、安全性和药代动力学特性，还应具有理想的理化特性，使得其稳定性能够满足生产、制剂工艺的技术要求。这一系列理化特性的评价，也称为“成药性”或“可生产性”评价。本文总结了目前成药性评价方法的研究进展。

关键词：治疗性蛋白、成药性、可生产性、理化性质、稳定性、制剂

前言

近年来，基于单克隆抗体的治疗性药物成为了制药企业研发管线中最重要的一部分。据统计，2016年处于临床研究中的抗体类药物分子数量在已超过了470个[1]，适应症范围覆盖了肿瘤、自身免疫、眼科及一些罕见病等多个方面。大分子蛋白药物在原液、制剂生产，及临床给药时常遇到的一个问题是蛋白的不稳定性。一方面由于蛋白质天然的稳定性显著低于小分子化药，另一方面为了达到天然蛋白所不具有的治疗特性，研究者们还应用蛋白质工程设计出了各种非天然蛋白，如双特异性抗体、融合蛋白等。而同时这些非天然蛋白的稳定性常常更加成为问题。一些理化特性较差的蛋白常常在生产、储存、给药过程中出现研究者不想看到的化学修饰、断裂和聚集等现象，这大大影响了药物的产率、活性，高分子聚集体还会造成免疫原性等方面的安全性问题。

过去很多研究机构主要基于生物学活性来筛选候选分子，其可生产性的相关影响因素在分子发现阶段并未纳入考量范围。但这些分子常常在推进到后期生产工艺开发阶段时，遇到稳定性等技术方面的问题而无法顺利商业化，从而导致大量资源被浪费。近5年来，越来越多的研发机构开始将成药性评价也纳入蛋白药物发现阶段，以得到最佳的药物分子。与小分子药物已有简单成熟的成药性评价标准：“里宾斯基五规则”[2]不同，大分子药物的成药性评价目前尚无类似的评价标准。本文结合近年来各方面的研究进展，将所报道的各种大分子成药性评价方法进行了综述。

蛋白质一级结构评价

药物发现的早期阶段一般采用计算机虚拟计算的方式对蛋白序列进行初步的评估，包括蛋白电荷性质的计算，潜在翻译后修饰位点，及可能的化学降解位点的寻找。如发现候选分子上有潜在的不稳定位点，可进一步使用少量纯化的样品进行强制降解实验来进行序列比较，并对降解位点进行鉴定。根据虚拟和实际实验结果，选择潜在不稳定位点较少的序列，或对高风险氨基酸位点进行突变，从而避免后期制造过程中这些风险位点造成的失败。

1.基本电荷性质评估

计算机基于氨基酸序列计算出的蛋白理论等电点（pI）和实际值有时会有一些差距，例如结构上相近的氨基酸侧链可能形成盐桥，进而影响其pKa值。罗氏的研究人员对比了9个单抗的理论预测pI和实验测得pI，相差约为±1[3]。因此，在用于成药性评价时，基于序列的理论预测准确度也已经足够。抗体类分子一般要求等电点高于7，从而保证该分子能够适用于下游纯化工艺平台中的阴、阳离子交换层析。另外，蛋白只有处在远离等电点的pH下，才能保证相对合适的溶解度，并控制聚集。因此候选分子的等电点也应远离生理条件的pH。

除了等电点，候选分子的整体电荷分布也应进行考量。极端不对称的表面电荷分布与蛋白自身相互作用、聚集和粘度等有关。由于表面电荷分布与蛋白高级结构有关，进一步的叙述见下文。

2.翻译后修饰位点评估

糖基化（N-Glycosylation）：抗体可变区糖基化的存在可能影响其结合活性和药代动力学特性，也是产品异质性的一个来源。N-糖基化固定发生在Asn-X-Ser/Thr位点，X为除脯氨酸之外的任意氨基酸，因此基于蛋白氨基酸序列的一级结构，即可分析推测出潜在的N-糖基化位点。尽管并不是所有这些位点在生产时均会被糖基化，但后期工艺的改变仍然可能改变这些位点的暴露状态，继而改变糖基化状态，带来产品特性改变的风险。

游离巯基（Unpairedcysteine）：候选抗体可变区的半胱氨酸可以通过序列有哪些信誉好的足球投注网站而发现。未配对的半胱氨酸残基可结合细胞培养基中的游离半胱氨酸、谷胱甘肽，及其他含有游离巯基的化合物，带来产品异质性。更糟糕的是，游离巯基在一些条件下（如pH7），可能会形成二硫键错配，并可能造成二硫键介导的二聚体甚至多聚体的产生。

糖化位点（Glycation）：赖氨酸的糖化作用是指氨基酸序列中的赖氨酸残基侧链与还原性糖，如葡萄糖、果糖发生的美拉德反应（Maillardreaction）[4]。该反应也是产品异质性的另一个来源，主要发生在细胞培养、储存等过程中，以及稀释至葡萄糖注射液中用于临床静脉滴注时。糖化作用在抗体中较为常见，并没有特异性的作用基序。在所报道的糖化发生案例中，有一些会影响抗体活性，而另一些则不会，这可能与其发生的具体位置有关。因此糖化作用仍然是成药性评价中值得考虑的一个因素，如