分离实验四 _原创精品文档.pdfVIP

1、掌握蛋白质在双水相系统中分配系数的测定方法。

2、了解蛋白质与考马斯亮蓝的显色反应原理及应用。

3、进一步巩固可见分光光度计的操作及制作标准曲线。

4、双水相萃取技术是分离纯化蛋白质混合物等生物大分子的有效方法。利用生物物质在

两相中不同的分配，可以实现它们的分离；生物大分子在双水相中上相和下相的

K=C/CPH

浓度比被定义为分配系数（tb）；分配行为受聚合物分子大小、成相浓度、、

无机盐种类等因素影响。

5、考马斯亮蓝与蛋白质可结合形成蓝色复合物，在595nm有最大光吸收，并且在低浓度时，

吸光值与蛋白质浓度服从朗伯比尔定律。

牛血清蛋白溶液、考马斯亮蓝染色液（G-250）、蒸馏水、相体积比实验中分离得到的

上下相、可见分光光度计、恒温水浴锅、移液管、试管及试管架等

1

（）制作标准曲线：

6牛血清蛋白溶液（120卩g/ml）0.000.20

①取支试管，用移液管分别准确加入体积为、、

0.400.600.801.00ml1.00ml

、、、，然后均用蒸馏水稀释至。

②再分别加入5.00ml考马斯亮蓝染色液，混匀。

C±C

③于251的恒温水浴锅中保温10min（为防止试管歪倒或混淆，可把水浴锅盖子打开，

将试管同试管架一起水浴）。

④冷却后，于595nm进行吸光值测定，以装有1.0ml蒸馏水的试管为对照。

gOD

⑤然后，以以试管中中蛋白质总量（卩）为横坐标，以相应的吸光值（595nm）为纵坐标

作图，得标准曲线。（注意所得6点至少应有3点在同一直线上，否则标准曲线不可用，应

参照其他组线性较好的标准曲线进行计算）

2

（）样品测定：（若颜色太深，一般要重新取样品再做）

Xml1.00ml1

上相溶液：用移液管吸取上相液，蒸馏水定容至，按（）法测定吸光值。

Yml1.00ml1

下相溶液：用移液管慢慢插入离心管底部，吸取下相液，蒸馏水定容至，按（）法测定吸光

ml13

值。（以上样品取的，往往要根据具体情况来调整。参考值：、只刻度离

0.1ml0.4ml240.3ml0.3ml

心管，上相取,下相取,、只刻度离心管，上相取,下相取）

2~67844

可按下表操作（为标准曲线，和代表实验三的四支离心管的个上相和个

下相）：

管号34