3种结肠癌细胞株中DLC-1基因的表达及其启动子区的甲基化状态研究.pdfVIP

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东南大学学嚣医ＪＳｏｕｈｔｅａｓｔＵｎＭｉｖ（ｅｄ鉴｛２ＳｃｉｉＥｄ）……’００８，Ｊａｎ；２７（１）：。…６－１０

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３种结肠癌细胞株中ＤＬＣ一１基因的表达

及其启动子区的甲基化状态研究

金月ｇ－，田小强，商延芳，黄培林

（东南大学基础医学院病理学与病理生理学系，江苏南京２１０００９）

［摘要］目的：研究候选抑癌基因ＤＬＣ・ｌ在结肠癌细胞株中的表达及其启动子区的甲基化状态，初步探讨结肠癌细胞株ＤＬＣ－ｌ基

因表达水平与其启动子区甲基化的相关性。方法：采用ＲＴ．ＰＣＲ技术分别检测ＤＬＣ－ｌ基因在人结肠癌细胞株ＣａＣｏ－２、ＨＴ－２９和

ＬｏＶｏ中的表达水平；应用甲基化特异性ＰＣＲ（ＭＳＰ）方法和亚硫酸氢盐修饰ＤＮＡ测序检测启动子区域甲基化状态；分别用０、

５、１０ｔｒｍｏｌ・Ｌ浓度的去甲基化药物５氮杂胞苷处理ＤＬＣ・ｌ基因启动子区域高甲基化状态细胞后，再检测ＤＬＣ－ｌ基因ｍＲＮＡ

表达水平。结果：人结肠癌细胞株ＣａＣｏ￣和ＬｏＶ０中ＤＬＣ－ｌｍＲＮＡ呈阳性表达，ＨＴ－２９中的表达呈阴性表达；ＣａＣｏ￣和ＬｏＶ０

细胞ＤＬＣ‘ｌ基因启动子区域未发生甲基化，而ＨＴ－２９出现启动子区高甲基化状态；经５氮杂胞苷药物干预后，ＨＴ－２９结肠癌细

胞的ＤＬＣ—ｌ基因表达明显增强。结论：结肠癌细胞株ＨＴ－２９中ＤＬＣ・ｌ基因表达沉默与启动子区高甲基化状态有关。

［关键词］ＤＬＣ・ｌ基因；甲基化；结肠癌细胞株；甲基化特异性ＰＣＲ

［中图分类号］Ｑ７５４［文献标识码］Ａ［文章编号］１６７１—６２６４（２００８）Ｏ１－ＯＯＯ６・０５

ＤＬＣ－１（￣ｅｑｕｅｎｄｙｄｅｌｅｔｅｄｉｎｌｉｖｅｒ，ＤＬＣ－１）基因，位１．２细胞总ＲＮＡ提取

于人类染色体８ｐ２１－２２，可能是一个新的抑癌基因。用Ｔｒｉｚｏｌ试剂一步法提取细胞总ＲＮＡ，以ＯｌｉｇｏｄＴ

１９９８年Ｙｕａｎ等¨首先用代表性差异分析技术（ｒｅｐｒｅ－（１８）为引物进行逆转录合成ｃＤＮＡ模板。以ＤＬＣ－１

ｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌｄｉｆｅｒｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ，ＲＤＡ）将其从原发性肝癌基因特异性引物进行ＰＥＲ扩增，引物分别位于第１和

组织中分离出来，并认为该基因的改变是肝癌的早期发第５外显子Ｊ，以ＪＢ－ａｃｔｉｎ为内参照（引物序列见表

生事件之一。随之，ＤＬＣ－１基因的功能及其在乳腺癌、１）。反应条件均为９４℃预变性３ｍｉｎ；９４ｏＣ变性３０Ｓ，

肺癌、胃癌和前列腺癌等恶性肿瘤中发病机制的研究陆按表１温度退火３０Ｓ，７２ｏＣ延伸４０Ｓ，共４２个循环；最

续展开。Ｙｕａｎ等研究认为，肝癌和胃癌中ＤＬＣ－１基后７２℃延伸７ｍｉｎ。ＰＥＲ产物于１．７％的琼脂糖凝胶

因启动子区域高甲基化可导致该基因表达沉默。电泳观察。

Ｗｉｌｓｏｎ等报道ＤＬＣ－１基因在结肠癌细胞株ＨＴ．１．３基因组ＤＮＡ的制备及亚硫酸氢盐修饰

２９、ＨＣＴ．１１６中表达沉默，但其相关机理尚不明了。为用饱和酚、氯仿抽提ＤＮＡ，乙醇沉淀。沉淀用

揭示ＤＬＣ－１基因在结肠癌中表达沉默的可能机制，作７０％乙醇洗涤，干燥后溶于ＴＥ缓冲液中，用紫外分光

者研究了候选抑癌基因ＤＬＣ－１在３种结肠癌细胞株光度计定量。取１—３基因组ＤＮＡ，３ｔｏｏｌ・Ｌ—

中的表达及其启动子区的甲基化状态，旨在探讨结肠ＮａＯＨ使ＤＮＡ充分变性。向已变性的ＤＮＡ中加入新

癌细胞株ＤＬＣ－１基因表达水平与其启动子区甲基化配制的３ｍｏｌ・Ｌ亚硫酸氢钠（ｐＨ５．０）