基因工程概论（4操作过程）.pptx

基因工程概论;4基因工程的操作过程;ADNA的体外重组（切与接）;5;BamHI;BamHI;5;CTGCA3;C3;重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数

在常规实验条件下，重组率一般为25-75%。

重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以

大大简化DNA重组的后续操作。;提高外源DNA片段与载体的分子比：5:1-10:1;加装同聚尾末端：;B重组DNA分子的转化和扩增（转与增）;;;;革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（即细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子。;不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所;取0.2-1ml的原生质体悬浮液（108-109个原生质体），加入10-20mlDNA重组连接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液，混匀。;感受态细胞的培养：

将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基中培

养至OD600=0.5；

吸附：

加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30℃保温10分钟；

转染裂解：

加入20倍体积的新鲜培养基，30℃培养2小时，直至培养液菌

体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选。;将待转化的质粒或DNA重组连接液加入到电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。

电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大。

同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验。;转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模中，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳载体DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）;例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4X1011个分子（6.02X1017/2686X660），也就是说，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞。

另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18DNA。;利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模。例;载体及DNA重组分子方面：;受体细胞方面：;转化方法方面：;转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：

Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时；

原生质体转化后的再生过程；

l噬菌体转染后的30℃培养等，均属扩增操作。;增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序;C转化子的筛选和鉴定（检）;C转化子的筛选和鉴定（检）;;抗药性筛选法的基本操作：;显色筛选法的基本原理：;显色筛选法的基本操作：;所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。;全酶解图谱法：;;菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基因或DNA片段的同源序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。其中，DNA同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据。;;杂交探针的标记：DNA聚合酶介导的缺刻前移标记;杂交探针的标记：地高辛系统标记;如果已知克隆的目标基因两侧的序列，便可合成引物，以待鉴定的重子DNA为模板，进行PCR扩增。能扩增出大小相符;淀粉酶目的基因的鉴定：;如果待筛选鉴定的目标蛋白既不能测定生物活性，又无现成的抗体使用，则可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行粗略的筛选。;4基因工程的操作过程