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全⾎胆碱酯酶活性的测定

全⾎胆碱酯酶活性的测定

――羟胺三氯化铁法

实验⽬的

1.掌握三氯化铁⽐⾊法的实验原理、分析步骤及酶测定的临床意义。

2.了解常见全⾎胆碱酯酶活性测定⽅法的优缺点、注意事项。

3.学会末梢⾎的采集。实验原理

⾎液胆碱酯酶使⼄酰胆碱分解为胆碱和⼄酸。未被胆碱酯酶⽔解⽽剩余的⼄酰胆碱和碱性羟胺反应，形成红⾊羌酸铁络合

物。颜⾊深度与剩余⼄酰胆碱的量成正⽐。在波长520nm⽐⾊定量，由⽔解的⼄酰胆碱的量计算胆碱酯酶活性。试剂和材料

采样、运输和保存⽤⾎⾊素吸管，取指⾎20⼙L,注⼊⽐⾊管中（事先加⼊0.98mL磷酸盐缓冲液）,⽴即进⾏测定。实验步骤

A样品管+0.98mL磷酸盐缓冲液+0.02mL全⾎却37C⽔浴5min——+1.0mL⼄酰胆碱应⽤液——37C⽔浴30min

B对照管0.98mL磷酸盐缓冲液+0.02mL全⾎+1.0mL⽔37

C⽔浴30min

C标准管1.0mL磷酸盐缓冲液-37C⽔浴5min+1.0mL⼄酰胆碱应⽤液37C⽔浴30min

D空⽩管1.0mL磷酸盐缓冲液37C⽔浴30min

蒸馏⽔

盐酸溶液（1+2）碱性羟胺溶液磷酸盐缓冲液（PH=7.20）

三氯化铁溶液

分光光度计10mL⽐⾊管漏⽃

恒温⽔浴箱，控温⼟05C采⾎针头⾎⾊素吸管

37C⽔浴5min——

37C⽔浴5min⼿+1.0mL⽔

⽔浴之后对A、B、C、D四个试管分别进⾏以下操作:

1.加⼊4.0mL碱性羟胺溶液，充分振摇2min；

2.加⼊2.0mL盐酸溶液，充分振摇2min；

3.加⼊2.0mL三氯化铁溶液，充分振摇；

4.滤纸过滤，520nm⽐⾊。

实验结果

表1-1520nm波长下样品的吸光度

样品编号ABCD

吸光度0.2990.0030.5380.000

结果计算

①计算酶活性的绝对值

3.149

Y=100=197

1.60

Y—酶活性的相对值，%;

Xs—被测⾎样中酶活性的绝对值，⼙mol(0.02mL?37C?30min);

Xc—正常⼈⾎中酶活性绝对值，⼙mol(0.02mL?37C?30min)。Xc=1.60⼙mol(0.02mL?37C?30min)

讨论

1.由于未在⽹上查到北京市居民胆碱酯酶活性的参考标准，遂以课件上浙江地区健康⼈

胆碱酯酶活性绝对值作为参考。即：⼥：3.19±0.398⼙mol;因3.149⼙mol在3.19±

0.398⼙mol的区间内，故该样本的胆碱酯酶活性属正常范围。

2.各组所测数值偏差较⼤，可能与操作差异如采⾎时间、振摇是否充分、加热时间等导

致胆碱酯酶活性变化有关。

带⼊得:

Xs=0.5380.0030.2997=3.149^mol

Xs：⽔解⼄酰胆碱的浓度，⼙

A:试剂空⽩为参⽐的在波长

以

0.538

mol(0.02mL?3730min);处

样品管的吸光度值;

520nm

B:以试剂空⽩为参⽐的在波长

C:以试剂空⽩为参⽐的在波长

②计算酶活性的相对值

520nm

520nm

处对照管的吸光度值;

处标准管的吸光度值。

3.采⾎要迅速，防⽌凝固及氧化；振摇要充分，同时防⽌液体溅出；⽐⾊时有以D管

调零。

注意事项

1?采⾎前应准备好试管，提前加⼊磷酸盐缓冲液；

2?采⾎时严格消毒，⽤过的采⾎针放⼊利器筒中，棉签放⼊垃圾桶中，不可混放；

3?准确控制⽔浴的温度和时间，否则会影响实验结果；

4?加⼊三氯化铁显⾊后，20min内⽐⾊。