蛋白表达纯化 PPT.pptVIP

蛋白表达纯化;研究目的：

生物学活性

纯度

数量

目的蛋白性质：

序列

相对分子质量

氨基酸组成

等电点

稳定性

亲水性;大肠杆菌表达系统

遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高

基本不分泌，容易形成包涵体，无糖基化等翻译后修饰

真核表达系统

可进行分泌表达，有天然立体结构及翻译后修饰

表达量较低，培养成本较高，操作较复杂

表达系统选择：目的蛋白性质，研究目的;大肠杆菌表达形式

可溶性表达：目的蛋白含有二硫键且需要正确的立体结构

包涵体表达：无活性要求，温度和诱导剂浓度影响

融合表达：小分子蛋白

大肠杆菌表达载体

融合表达：融合各种tag，GST,CBD,GFP等

单纯表达：pJLA系列，用NcoI/NdeI导入AUG的载体

NdeI识别序列：5CA^TATG3

IPTG诱导：lac，T5，T7启动子

热诱导：lamdaphagePL和PR启动子

表达载体选择：研究目的，目的蛋白性质和预计纯化方法;5;重组蛋白质在大肠杆菌中的表达和纯化

步骤1.目标基因全基因合成

步骤2.目标基因亚克隆

步骤3.E.coli表达菌株转化及筛选

步骤4.目标蛋白表达及纯化;步骤1.目标基因全基因合成：

1.从基因库中有哪些信誉好的足球投注网站目标蛋白的cDNA序列。

2.根据选用的表达系统对cDNA进行密码子，mRNA二级结构等的优化。

3.合成设计好的基因序列，将目标基因亚克隆到合适的复制质粒上。

提取mRNA，逆转录PCR得到cDNA;大家有疑问的，可以询问和交流;步骤2.目标基因亚克隆：

1.扩增并抽提含有目标基因的载体质粒。

2.将目标基因亚克隆到合适的表达质粒上。

3.测序验证构建质粒的准确性。;步骤4.目标蛋白表达及纯化：

1.对时间，温度以及IPTG浓度等表达条件进行优化，诱导表达目标蛋白。

2.培养重组细菌，通过亲和，离子交换，疏水及凝胶过滤等层析方法纯化表达的重组蛋白。

3.通过SDS电泳检测每步结果并控制最终产品质量。

4.通过Western-blot验证目标蛋白正确性，根据蛋白质性质检测其活性;蛋白质纯化常用预处理技术：

1、菌体破碎。超声、冻融、溶菌酶

2、离心沉淀。利用离心沉降力将不溶性颗粒物与溶液分离的技术。

3、过滤。澄清过??、除菌过滤

4、盐析。常采用硫酸铵、硫酸钠盐析

5、等电点沉淀。根据蛋白质、多肽在等电点时溶解度最小的特点进行。

6、有机溶剂沉淀。采用冷的丙酮、乙醇沉淀蛋白质。例如人血浆蛋白的乙醇分级沉淀。

7、变性沉淀。根据目的蛋白质、多肽对于温度或者酸碱性的耐受性，在较高的温度或者较极端的pH条件下处理样品，使杂质去除的方法。;蛋白质纯化常用层析方法

1、凝胶过滤。根据分子大小和形状进行分离的一种方法，分子量较大的先出峰，分子量小的后出峰。

2、离子交换色谱。蛋白质、多肽均属于两性电解质，在缓冲液pH小于其等电点时，带净正电荷，而在缓冲液pH大于其等电点时，带净负电荷。阴离子交换凝胶本身带有正电荷基团，阳离子交换凝胶本身带负电荷基团。由于静电相互作用而使样品结合到凝胶上，再采用盐浓度梯度或者更换缓冲液的pH值进行洗脱。对于等电点小于5.0的酸性蛋白质，推荐使用阴离子交换，对于等电点大于7.0的碱性蛋白质，推荐使用阳离子交换。

3、疏水作用色谱。利用蛋白质、多肽在高盐存在下，可以结合疏水凝胶，而在盐浓度降低时又可以解脱的原理实现分离。

4、亲和色谱。利用蛋白质、多肽与配基的特异性相互作用而进行分离。

5、反相色谱。常用于蛋白质、多肽的HPLC分析，以及多肽的精细制备分离，分辨率极高。;各种色谱的主要影响因素

填料性质

样品浓度

上样体积

洗脱流速

工作缓冲液的pH值，离子浓度;蛋白质纯化常用衔接技术：

1、透析。根据目的蛋白质、多肽的分子量，选取适宜的透析袋进行透析，可以起到更换缓冲液以及去除一些低分子杂质的目的。2、超滤。根据目的蛋白质、多肽的分子量，选取适宜截留分子量的超滤膜进行超滤。

3、脱盐。透析、超滤可用于进行脱盐，SephadexG25、G50常用于蛋白质脱盐。;包含体表达蛋白的纯化：

在E.coli系统表达重组蛋白，表达量高时，常形成包含体，包含体易于与细胞其他组分分离，但需要注意的是蛋白复性的步骤。一般采用盐酸胍溶解包含体蛋白后，用稀释的办法进行复性，也可以利用透析、凝胶过滤色谱等方法进行复性。;16