DB22T 2623.3-2017 黑木耳菌种区别性及真实性鉴定 第3部分：SRAP法　　.docxVIP

ICS65.020.01B05

备案号：56324-2017DB22吉林省地方标准

DB22/T2623.3—2017

黑木耳菌种区别性及真实性鉴定第3部分：SRAP法

VerificationofdistinctnessandgenuinenessforBlackwoodearspawn

Part3:SRAP

2017-06-12发布2017-08-12实施

吉林省质量技术监督局发布

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前言

《黑木耳菌种区别性及真实性鉴定》分为以下3个部分：

——DB22/T2623.1黑木耳菌种区别性及真实性鉴定第1部分对峙培养法

——DB22/T2623.2黑木耳菌种区别性及真实性鉴定第2部分酯酶同工酶法——DB22/T2623.3黑木耳菌种区别性及真实性鉴定第3部分SRAP法

本部分为第3部分：SRAP法。

本标准按照GB/T1.1—2009和GB/T20001.4—2015给出的规则起草。本标准由吉林省农业委员会提出并归口。

本标准起草单位：吉林农业大学、吉林省海外农业投资开发集团有限公司。

本标准主要起草人：姚方杰、张友民、方明、陈影、鲁丽鑫、王鹏、姚允武、于娅、刘宏宇、李丹、王晓娥、陈艳秋、刘迪、张伟彤、孔祥会、马晓旭、张媛媛、李玉。

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黑木耳菌种区别性及真实性鉴定第3部分：SRAP法

1范围

本标准规定了黑木耳菌种真实性SRAP法的原理、试剂和材料、仪器设备、样品、试验步骤、试验数据处理。

本标准适用于黑木耳菌种真实性鉴定。

2术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。2.1

引物primer

适用于黑木耳菌株真实性鉴定的一定长度和顺序的寡核苷酸链。2.2

PCR空白对照PCRcontrolcheck

以无菌水作为模板进行PCR反应，以验证PCR反应过程中是否发生污染。2.3

阴性提取对照negativecontrol

水作为材料提取DNA，以证明黑木耳DNA在制备过程中是否发生污染。

3原理

对黑木耳菌种的ORFs区域中内含子、启动子进行特异扩增，检测和比较该序列长度多态性。通过对PCR产物的检测和比较，识别黑木耳菌种基因组DNA的多态片段，鉴定菌种的真实性。

4试剂和材料

4.1培养基：见附录A。

4.2四种脱氧核糖核苷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)混合溶液。4.3TaqDNA聚合酶。

4.4核酸染料。

4.5DNA分子量标记。

4.6引物：参见附录C。

4.7剥离硅烷。4.8亲和硅烷。

4.91mol/LTris-HCl(pH8.0)：见附录B.1。

4.100.5mol/L乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-2Na)溶液：见附录B.2。

4.11CTAB提取缓冲液：见附录B.3。

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4.12CTAB纯化缓冲液：见附录B.4。

4.13氯仿异戊醇（24:1）：见附录B.5。

4.14酚-氯仿异戊醇（25:24:1）：见附录B.6。

4.1570%乙醇溶液：见附录B.7。

4.1630%丙烯酰胺溶液：见附录B.8。

4.1710%过硫酸铵：见附录B.9。

4.188%聚丙烯酰胺凝胶溶液：见附录B.10。

4.195×TBE缓冲液：见附录B.11。

4.201×TBE缓冲液：见附录B.12。

4.210.1%硝酸银（AgNO3）溶液：见附录B.13。

4.22显影液：见附录B.14。

4.23液氮。

5仪器设备

5.1PCR扩增仪。

5.2高速冷冻离心机（10000rpm以上）。5.3紫外分光光度计。

5.4全温摇瓶柜：精度±0.1℃。5.5凝胶成像系统。

5.6电热恒温水浴槽：精度±0.1℃。5.7垂直板电泳槽。

5.8稳压稳流电泳仪。

5.9分析天平：感量0.01g、0.0001g各一台。

6样品

6.1菌丝体培养

直接将接种块接入三角瓶液体培养基中，25℃,120rpm振荡避光培养20d。培养基的制备参见附录A。

6.2DNA样品提取

6.2.1菌丝培养量以可做3次平行试验为准，固体