DB22T 2628-2017 鹅细小病毒检测 聚合酶链式反应(PCR)法　.docxVIP

ICS11.220B41

备案号：56329-2017DB22吉林省地方标准

DB22/T2628—2017

鹅细小病毒检测聚合酶链式反应（PCR）法

Detectionmethodofpolymerasechainreactionforgooseparvovirus

2017–06-12发布2017-08-12实施

吉林省质量技术监督局发布

I

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前言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。

本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院、吉林省动物疾病预防控制中心、吉林省畜牧总站、吉林省牧业信息中心、梅河口市畜牧总站、榆树市动物卫生监督所。

本标准主要起草人：邵洪泽、黄海楠、孙亮、董航、李昱洁、王楠、郭衍冰、毛文智、呼延含蓉、卢松岩、张涛、李桂华、陆秀娟。

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鹅细小病毒检测聚合酶链式反应（PCR）法

警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。

1范围

本标准规定了鹅细小病毒检测方法的操作步骤和结果判定。本标准适用于鹅细小病毒的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫

3生物安全措施

为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测，所有培养物和废弃物应按照GB19489中的有关规定执行。

4防污染措施

防止污染措施应符合GB/T27401的规定。

实验室应根据实验要求分为相对独立的工作区域，避免不同工作区域内的设备、物品混用；每一个区域须有专用的仪器设备。

5试剂

除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。

5.1PCR反应试剂如下：

——10×PCR扩增缓冲液，见附录A中A.1；——2U/μLTaqDNA聚合酶；

——10mmol/LdNTPs；——灭菌ddH2O。

5.2DNA提取试剂盒或DNA抽提试剂如下：

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——TE缓冲液（10mmol/LTris-HCl，pH8.0，1mmol/LEDTA，pH8.0），见附录A中A.2；——酚-氯仿-异戊醇（25/24/1V/V）；

——异丙醇；

——70%乙醇。

5.3其他试剂

——生理盐水；

——1倍TAE电泳缓冲液，见附录A中A.3；——凝胶加样缓冲液，见附录A中A.4；

——10mg/mL溴化乙锭（EB），见附录A中A.5，或其他DNA染料替代品；——1.5%琼脂糖凝胶，见附录A.6；

——矿物油；

——DNAmarker。

5.4阳性对照

鹅细小病毒DNA或含有VP3基因片段的质粒。

5.5阴性对照灭菌ddH2O。

5.6引物

PCR引物浓度与序列，预计扩增片段375bp，见表1。

表1特异性引物浓度及序列

引物

引物序列

使用浓度pmol/μL

上游引物下游引物

5-CCAAGCTACAACAACCACATCTAC-35-CTGCGGCAGGGCATAGACATCCGAC-3

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6仪器

6.1普通PCR仪。

6.2低温高速离心机（12000g以上）。6.3电泳槽。

6.4电泳仪。

6.5紫外线灯或紫外凝胶成像仪。

6.6可调微量移液器（200μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL、0.5μL～10μL）。6.7Eppendorf管（1.5mL、0.5mL、0.2mL）。

6.8枪头（200μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL、0.5μL～10μL）。6.9水浴箱（室温～100℃)或微波炉。

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