DB22T 2630-2017 羊传染性脓疱病毒检测 环介导等温扩增(LAMP)法.docxVIP

ICS11.220B41

备案号：56331-2017DB22吉林省地方标准

DB22/T2630—2017

羊传染性脓疱病毒检测环介导等温扩增（LAMP）法

ThedetectionofOrfvirusbyLoop-MediatedIsothermalAmplification（LAMP）method

2017-06-12发布2017-08-12实施

吉林省质量技术监督局发布

I

DB22/T2630—2017

前言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。

本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院，吉林省动物疫病预防控制中心。

本标准主要起草人：程荣华、邵洪泽、呼延含蓉、柴方红、卢松岩、王楠、李文东、毛文智、刘沂霖、赵欣、石春军、陆伟、何浩、孙健。

1

DB22/T2630—2017

羊传染性脓疱病毒检测环介导等温扩增（LAMP）法

警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。

1范围

本标准规定了羊传染性脓疱病毒环介导等温扩增检测方法的操作步骤、结果判定。本标准适用于羊传染性脓疱病毒的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3试剂材料

3.1试剂

3.1.1DNA提取试剂盒3.1.2LAMP试剂

——10×BstDNA聚合酶缓冲液（200mmol/LTris-HCl，100mmol/LKCl，100mmol/L(NH4)2SO4，

20mmol/LMgSO4，1%Triton-100，pH8.8，25℃);——25mmol/LMgCl2；

——10mmol/LdNTPs混合物：包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP；——8U/μLBstDNA聚合酶；

——5mol/LBetaine；——ddH2O。

3.1.3其他试剂

——SYBRGreenI染料。

3.2特异性引物

引物序列，见表1（引物浓度）。

2

DB22/T2630—2017

表1特异性引物序列

引物种类

引物名称

核苷酸序列

外引物

F3B3

5-GACCCCGAGCTCATGGT-3

5-GCCGCGTCTTCACCTGTA-3

内引物

FIP

5-CCTCCTTGATGATCGCGTCGT-GACGTCTCGCTAGACGCCTA-3

BIP

5-GAGGTGTTCACGCTGGAGAAGC-AGTACTCGGGGTAGACCAC-3

环引物

LF

5-GAGCTTCTTCATGCCGCC3

3.3阴性对照

ddH2O。

3.4阳性对照

羊传染性脓疱病毒DNA或含目的片段的质粒。3.5耗材

——PE无菌手套或乳胶手套；

——Eppendorf离心管1.5mL；

——PCR反应管200μL；——吸头。

4仪器设备

——研磨器；——振荡器；

——电子天平：感量0.1g；

——小型高速离心机：1000r/min-16000r/min；；——LAMP仪或水浴锅（室温至100℃);

——微量移液器。

5操作步骤

5.1样品前处理

采取可疑病羊或病死羊的口、鼻、唇等部位水泡、脓疱、结痂等病料（2g）加4mL灭菌生理盐水研磨成匀浆，反复冻融(-20℃)3次。将匀浆液3000r/min离心30min，取上清液为检测样品。

5.2DNA模板的制备

使用试剂盒提取病毒DNA或取1mL样品放入1.5mLEppendorf管中，置100℃煮沸5min，12000

r/min离心10min，取上清液为DNA模板，-20℃保存备用。

5.3LAMP检测方法

3

DB22/T2630—2017

5.3.1反应体系

按下列试剂用量在PCR反应管中分别加入各成分：——10×BstDNA聚合酶缓冲液：2.5μL；

——引物：