2024届高考生物二轮复习教师用书(学案) 第一篇 主题五 高考热点(五.pdfVIP

PCR的应用

随着生物技术的飞速发展，曾经遥不可及的PCR技术逐步走进了高中实验室。PCR技

术应用广泛，如实时荧光定量RT－PCR技术、重叠延伸PCR、大引物PCR、反向PCR、巢

式PCR等，高考试题中有关PCR的问题越来越多，设问考查深度也明显提升。各种PCR技

术不是孤立的，它们均以常规PCR为基础，为实现特定目的而进行了一定改进，但也有各自

的局限性，因此在必要时可同时使用几种扩增技术，如多重巢式PCR、反向实时荧光定量PCR

等。

在高考备考中，要关注不同扩增技术的本质差异，同时总结此类试题的解答步骤：一是

寻找题图有效信息，确定所考PCR类型；二是迅速再忆所考PCR的独特性，猜测出题人可

能的意图；三是根据设问对前述猜测进行验证，并领悟出题人挖掘的新考点，进而对知识框

架进行完善。

1．实时荧光定量RT－PCR技术检测病毒核酸

病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。实时荧光PCR扩增目的基因，需额外

添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，

不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被耐高温的DNA聚合酶水解，R与Q

分离后，R发出的荧光可被检测到(如图甲)，通过实时荧光PCR检测某冠状病毒感染时，检

测到的荧光强度变化如图乙，荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)越小，说明病毒核酸浓

度越高。

2．PCR定点突变——重叠延伸PCR技术

重叠延伸PCR技术其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处

代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在

随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。如某科研团队运用重叠延伸PCR

技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、

AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图：

3．PCR定点突变——大引物PCR技术

大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游

引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整

的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游

大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。原理如图。

4．反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列

当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。

原理是：用限制酶消化该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得

了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向

的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序

列。原理如图。

5．巢式PCR

首先将目标的DNA模板与第一套引物(外引物)结合。第一套引物也可能结合到其他具有相似

结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片段(图中未显示可能的多种产

物)。然后使用第二套引物(内引物)对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。由于第

二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片段包含两套引物结合位点的可能性极小，因

此第二套引物不可能扩增非目的片段。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完

全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。原理如图。

1．(2023兰州高三质检·)实时荧光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR

复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭

基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。

利用RT－PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是()

A．做RT－PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针

B．RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA反转录为cDNA后再进行扩