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紫外可见分光光度

计操作规程

紫外-可见分光光度计操作规程

(TU1810)

1．目的：制订本标准的目的是为规范检验人员在质量检验过程中的操作，保证检验结果的正确性。

2．适用范围：本标准适用于二厂检验员对产品质量的检验。

3．职责：QC检验员对本标准的实施负责。

4．程序：

4.1简述

紫外-可见分光光度法是利用物质分子对紫外可见光谱区的辐射的吸收来进行分析的一种仪器分析方法。这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电子在电子能级间的跃迁，它广泛用于无机和有机物质的定性和定量分析。

朗伯一比耳定律(Lambert—Beer)是光吸收的基本定律，俗称光

吸收定律，是分光光度法定量分析的依据和基础。当入射光波长一定时，溶液的吸光度是吸光物质的浓度及吸收介质厚度(吸收光程)的函数。其常见表示式为，式中为系数：

式中A为吸光度；

￡为吸收系数；

C为溶液浓度；

I为光路长度。

如溶液的浓度（C）为1%（g/ml），光路长度（L为1cm，相应的吸光度即为吸收系数以E1%表示。如溶液的浓度（C）的摩尔浓度

E1cm

（mol/L），光路长度为1cm时，则相应有吸收系数为摩尔吸收系数，

以￡表示。

4.2仪器

紫外可见分光光度计是基于紫外可见分光光度法的原理工作的常规分析仪器。根据光路设计的不同，紫外可见分光光度计能够分为单光束分光光度计、双光束分光光度计和双波长分光光度计。

4.2.1仪器测量条件选择

测量波长的选择

一般都是选择最强吸收带的最大吸收波长入 max作为测量波长，称

为最大吸收原则，以获得最高的分析灵敏度。而且在入 max附近，吸

光度随波长的变化一般较小，波长的稍许偏移引起吸光度的测量偏差较小，可得到较好的测定精密度。但在测量高浓度组分时，宁可选用灵敏度低一些的吸收峰波长（￡较小）作为测量波长，以保证校正曲线有足够的线性范围。如果入max所处吸收峰太尖锐，则在满足分析灵敏度前提下，可选用灵敏度低一些的波长进行测量，以减少比耳定律的偏差。

适宜吸光度范围的选择

任何光度计都有一定的测量误差，这是由于测量过程中光源的不稳定、读数的不准确或实验条件的偶然变动等因素造成的。由于吸收定律中透射比T与浓度C是负对数的关系，从负对数的关系曲线能够看出，相同的透射比读数误差在不同的浓度范围中，所引起的浓度相对误差不同，当浓度较大或浓度较小时，相对误差都比较大。因此，要选择适宜的吸光度范围进行测量，以降低测定结果的相对误差。

在实际工作中，可经过调节待测溶液的浓度或选用适当厚度的吸收池的方法，使测得的吸光度落在所要求的范围内。

仪器狭缝宽度的选择

狭缝的宽度会直接影响到测定的灵敏度和校准曲线的线性范围。狭缝宽度过大时，入射光的单色光降低，校准曲线偏离比耳定律，灵敏度降低；狭缝宽度过窄时，光强变弱，势必要提高仪器的增益，随之而来的是仪器噪声增大，于测量不利。选择狭缝宽度的方法是：测量吸光度随狭缝宽度的变化。狭缝的宽度在一个范围内，吸光度是不变的，当狭缝宽度大到某一程度时，吸光度开始减小。因此，在不减小吸光度时的最大狭缝宽度，即是所欲选取的合适的狭缝宽度。

4.3紫外-可见分光光度计的检定

4.3.1波长示值误差与重复性

仪器波长示值误差指标为士0.3nm，波长重复性指标为0.2nm，您

能够用仪器氘灯的两条特征谱线检验，具体检验方法如下：

确认仪器光谱宽带为“2.0nm”。开机初始化完成后，按数字5键进入系统应用界面，在系统应用界面中按数字键2强狭缝设定为

“2.0nm”。

在系统应用界面按RETURN键返回仪器主界面，按2键选择光谱测量功能。

按F1键选择参数设定功能，按相应数字键设定采样间隔为

0.2nm、扫描速度为 中速、波长范围为660nm~48Onm、纵坐

标范围0-100、测光方式Es、光源选择氘灯

按RETURN?返回光谱扫描界面。

按START/ST0键并输入增益值为6,按ENTERS确认，开始扫描。

扫描结束后，按F2键并输入阈值（1~100）后，按ENTERS进行峰值检出（如果检出峰波长为0.000nm，则需要按键返回，然后重新按

F2键输入比前次输入小的数值作为阈值，重新进行峰值检出）

⑦按F4键打印输出

重复扫描三次，并做峰值检出，氘灯的两个峰标准值为 656.1nm和

486.0nm。

4.3.2基线平直度样品池中不放任何遮挡物,以空气为空白进行测量,用波长扫描功

能测量全波段的吸光度值,其具体测量方法如下

首先确认仪器光谱宽带为2.0nm

在仪器主界面俺2键选择光谱测量模式

按F1键进入参数设置界面，按相应的数字键设置测光方式Abs、采样间隔为1nm、扫描速度为中速、波长范围为1100~