DB22T 2704-2017 牛卵形巴贝斯虫病检测方法 PCR法.docxVIP

ICS11.220B41

备案号：56317-2017DB22吉林省地方标准

DB22/T2704—2017

牛卵形巴贝斯虫病检测方法PCR法

PCRassayfordetectionofbovineBabesiaovata

2017-09-30发布2017-11-30实施

吉林省质量技术监督局发布

I

DB22/T2704—2017

前言

本标准按照GB/T1.1—2009和GB/T20001.4—2015给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。

本标准起草单位：延边大学、吉林省动物疫病预防控制中心、延边朝鲜族自治州畜牧总站。本标准主要起草人：贾立军、梁晚枫、柴方红、黄国明、张魁、王海军。

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DB22/T2704—2017

牛卵形巴贝斯虫病检测方法PCR法

1范围

本标准规定了牛卵形巴贝斯虫病PCR检测方法的技术要求。本标准适用于牛卵形巴贝斯虫病原检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

3.1

卵形巴贝斯虫病babesiosis

由牛卵形巴贝斯虫（Babesiaovata）寄生于牛的红细胞内，以高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿等为主要特征的血液寄生虫病。

4原理

双链DNA在高温加热的作用下变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则，通过人工合成的特异性寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链，再利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)合成新生的DNA互补链，进而完成特定片段的体外扩增。

5试剂和溶液

除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。5.1试剂

5.1.1TaqDNA聚合酶。

5.1.2dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）。

5.1.3血液DNA提取试剂盒。

5.1.4DNAMarker分子量标准。

5.2常规试剂配制

5.2.150×TAE缓冲液见附录A.1。

5.2.2加样缓冲液见附录A.2。

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5.2.310mg/mL溴化乙锭见附录A.3。

5.2.41%琼脂凝胶见附录A.4。5.3引物

PCR反应引物序列与浓度见表1。

表1PCR反应引物序列与浓度

引物

引物序列

DNA序列

长度/bp

浓度/pmol/μL

上游引物

5’-GCCCGCAGGTCATCATAAAGT-3’

AB367928.1

1008

10

下游引物

5’-CATTTTGTGCCAGCGTTTTG-3’

5.4仪器设备

5.4.1PCR扩增仪,温度范围：4℃~100℃。

5.4.2低温高速离心机,12000r/min以上。

5.4.3高压灭菌器,120℃以上。

5.4.4恒温水浴锅,室温～100℃。

5.4.5分析天平,感量0.1mg。

5.4.6电泳槽,水平电泳槽。

5.4.7电泳仪,电压1V～300V；电流1mA～400mA。

5.4.8凝胶成像系统,带紫外灯。

5.4.9微量加样器,单道2μL、10μL、20μL、100μL和200μL。

5.5试验样品

对无菌采集的待检牛血液样品，封装于洁净塑料离心管或玻璃试管内，编号。冷藏条件下送实验室检测。

6试验步骤

6.1模板DNA制备

按血液基因组DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA见附录B。

6.2检测血样PCR反应

在PCR反应管中按表2依次加入反应试剂，反应体系为25μL。反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性50s，50℃退火60s，72℃延伸50s，循环30次；72℃延伸7min，4℃保存。

表2PCR检测反应体系

试剂

体积

10×PCR缓冲液

2.5μL

2.5mmol/LdNTP

2.0μL

表2（续）

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试剂

体积

10μmol/L上