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脂肪酶活检测原理及方法

脂肪酶活检测原理及实际方法：

一、原理以及标准曲线做法

1.对硝基苯酚酯（4-Nitrophenylester）是脂肪酶

水解活力测定中运用最为广泛的一种

底物，脂肪酶水解其产生pNP（对硝基苯酚）在

碱性条件下显黄色，在410nm下有吸光值，且

灵敏度很高。

2.所需试剂有：

CAS碳链长度出货号

价格名称

830-03-5C2N8130-1G￥462对硝基苯乙酸酯

2635-54-9C4N9876-1G￥570对硝基苯丁酸酯

1956-10-1C821742-1G-F￥487对硝基苯辛酸酯

1956-11-2C1261716-1G￥435对硝基苯月桂酸酯

1492-30-4C16N2752-1G￥379对硝基苯棕榈酸酯

14617-86-8C18N3627-1G￥2621.97对硝基苯硬酸脂

全部为色谱纯试剂，购于sigma公司

3.标准曲线绘制：

a.标准对硝基苯酚母液(2mM，2mmol/L):

称取0.02789g的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml

的溶液B（即不同pH的缓冲液），置于棕色试

剂瓶内，4℃冰箱保存。

方法一：

b.标准曲线绘制：

分别取0.02，0.04，0.06，0.08，0.12，0.16ml

的对硝基苯酚母液(2mM)，用溶液B（即不同pH

的缓冲液）稀释至4ml，分别测定在410nm处

的吸收值。以对硝基苯酚浓度x（对应浓度分别

是0.01，0.02，0.03，0.04，0.06，0.08，单位：

mM）为横坐标，吸光值y为纵坐标，绘制标准

曲线。

方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处

理，获得吸光度。

b.标准曲线的绘制：

分别取0、1.875、3.75、7.5、15、22.5、30、45

μL的对硝基苯酚分别加入62.5、60.625、58.75、

55、47.5、40、32.5、17.5μL的异丙醇和（全部

都是）562.5的溶液B，40℃15min，95%乙醇，

10000r/min，3min，测出标准曲线。

上表是方法一测得标

准曲线

脂肪酶酶活定义：在410nm下测定吸光值,以1

min内催化水解底物对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)

产生1μmol对硝基苯酸(p-NP)所需的酶量为1

个酶活单位(U)。

公式y=14.474x+0.0272中x是p-NP的浓度(单

位：mmol/l)，y是吸光值，14.474、0.0272是反

应系数，R2是相关系数。则，酶活计算公式为：

酶活=1000*n*V*(y-0.0272)/14.474t其中n为

稀释倍数，t为反应时间（单位：min），V为反

应体系的总体积（单位：L）、1000是mmol到

μmol的比例。

二、底物耐碱性测定及试验液配制

1.底物耐碱性测定

a.