黄色短杆菌ilvBN和ilvC基因定点突变对L-缬氨酸发酵的影响 .pdfVIP

黄色短杆菌ilvBN和ilvC基因定点突变对L-缬氨酸发酵的影

响

宫卫波;王海雷;程国平;赵津津

【摘要】以黄色短杆菌MH-1000为出发菌株,使用PCR技术克隆ilvBN与ilvC

基因,对ilvBN进行定点突变,获得解除L-缬氨酸对乙酰羟酸合酶反馈抑制突变型基

因ilvBN′.对基因ilvC进行点突变,获得乙酰羟酸变位酶突变基因ilvC′.通过重叠延

伸PCR方法,将基因片段ilvBN′和ilvC′拼接为ilvBN′C′,进而连接至穿梭载体

pXMJ19获得重组质粒pXMJ19-ilvBN′C′.该重组质粒转化至出发菌株获得工程菌

株MH-1032.50L分批补料发酵结果显示:MH-1000发酵72hL-缬氨酸质量浓度为

35.2g/L,MH-1032发酵72hL-缬氨酸质量浓度为38.4g/L,增长9.1%,糖酸转化

率从21.7%提高到25.8%.

【期刊名称】《发酵科技通讯》

【年(卷),期】2017(046)004

【总页数】6页(P228-232,237)

【关键词】L-缬氨酸;乙酰羟酸合酶;乙酰羟酸变位酶;黄色短杆菌

【作者】宫卫波;王海雷;程国平;赵津津

【作者单位】廊坊梅花生物技术开发有限公司,河北廊坊065001;廊坊梅花生物技

术开发有限公司,河北廊坊065001;廊坊梅花生物技术开发有限公司,河北廊坊

065001;廊坊梅花生物技术开发有限公司,河北廊坊065001

【正文语种】中文

【中图分类】TQ922

L-缬氨酸作为增味剂、添加剂，应用于食品、饲料、医药和化妆品等领域.L-缬氨

酸是人体必需八种氨基酸之一.工业上主要使用发酵法生产L-缬氨酸，所用菌种以

棒杆菌为主.一般通过增强L-缬氨酸代谢通路关键酶、限速酶的表达[1-2]，阻断或

者减弱支路代谢[3-4]，改变细胞膜对底物和产物透性，增强细菌对糖等底物的耐

受，抑制终产物分解[5-7]等方法提高L-缬氨酸产量.另外优化发酵培养基配方、改

善发酵工艺也可提高L-缬氨酸产量[8-9].徐庆阳等[10]以黄色短杆菌(B.

flavum)XV0505(Leu-+Ile-+2-TAr+α-ABr+SGr)在10L小罐中发酵72h，最高

产L-缬氨酸53.4g/L，糖酸转化率为26.7%.张伟国等[11]通过诱变筛选出了XQ-

8(Leulα+ABhr+2-TAhr+AHVhr)，摇瓶产酸达66g/L.但是以诱变为基础的菌株

筛选效率比较低，现基本被基因工程手段替代.

笔者采用对ilvBNC进行定点突变的方法，解除了L-缬氨酸对乙酰羟酸合酶(AHAS)

的反馈抑制，同时经过定点突变，将乙酰羟酸变位酶(AHAIR)的辅酶NADPH改为

NADH，摇瓶发酵产L-缬氨酸19.5g/L，比突变前提高16.8%；50L发酵罐产L-

缬氨酸38.4g/L，比突变前提高9.1%.

大肠杆菌transT1(北京全式金生物技术有限公司)，黄色短杆菌MH-1000(α-

ABhr+2-TAhr+AHVhr)，廊坊梅花生物技术开发有限公司保藏菌种.

大肠杆菌-棒杆菌穿梭质粒pXMJ19，本实验所使用的菌株及载体详见表1.

限制性内切酶、DNA连接酶，MBIFermentas公司；FastpfuDNA

polymerase，TransStartFastTaqDNApolymerase，TransStartFastPfuDNA

polymerase，DNAMarker，dNTPs等，北京全氏金生物技术有限公司；质粒小

量提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、基因组提取试剂盒，北京天根生化

科技有限公司；引物合成及测序送交英潍捷基(上海)贸易有限公司完成；往复式摇

床、恒温培养箱、PCR仪、电泳-凝胶成像系统等；SBA生物传感仪，山东省科学

院微生物研究所；50L发酵罐，上海百仑生物科技有限公司.

LB培养基：氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，121℃灭菌20min.

黄色短杆菌摇瓶及50L小罐发酵培养基配制参考文献